Миф о древних ДНК-генеалогических линиях африканцев (часть 1). Древняя днк

Древняя ДНК: Привет из прошлого

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания Генотек.Конкурс поддержан ОАО «РВК».

Обратите внимание!

Эта работа представлена на конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014 в номинации «Биоинформатика и молекулярная эволюция».

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики. Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon. Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Как найти археологическую сенсацию?

Не секрет, что главное и основное условие при работе с древней ДНК — это превосходная сохранность материала, которая может быть обеспечена комплексом условий. Поэтому на сегодняшний день наибольшее число научных работ по этой тематике основано на образцах, чей возраст не превышает пятидесяти тысяч лет, причем храниться они должны были в идеальных условиях — минимальной температуре и наименьшей влажности (рис. 1).

Условная фаланга пальца, обнаруженная археологом в условной пещере, как правило, лишь начало длинного пути к пониманию того, кем же был этот условный человек, и был ли он человеком в научном смысле этого слова. Причем, дабы не упрощать работу археологов, следует отметить, что на поиск условной фаланги может уйти не один десяток лет, в течение которого сотни практикантов будут просеивать тонны осадочной породы в поисках того, что сможет перевернуть современные представления о прошлом. Но мы не будем забегать настолько далеко, ведь после археологической работы с найденной фалангой предстоит плодотворно поработать еще двум группам людей (рис. 2).

Палеогенетики: спасение утопающих — дело рук самих утопающих

Вслед за археологами в работу включаются молекулярные биологи, которых в дальнейшем для простоты мы будем называть палеогенетиками. Пожалуй, и книги не хватит для того, чтобы описать те «муки», с которыми столкнутся последние. В помощь им — самые разнообразные ими самими (воистину, спасение утопающих — дело рук самих утопающих! — прим. автора) разработанные методики и подходы.

Рисунок 1. Денисова пещера на Алтае. Фото автора.

Рисунок 2. Фаланга пальца неандертальца, найденная в Денисовой пещере в 2010 году [4].

Первое, недолго думая, они «отобрали» у стоматологов их основное орудие труда. На начальной стадии при работе с костями или зубами* биологи активно используют ненавистную с детства стоматологическую бормашину, которой они высверливают ткань, перетирая ее в муку.

При этом их основной интерес вызывают некогда пронизанные кровеносными сосудами элементы ткани — сюда с меньшей вероятностью попадают различные бактерии, разрушающие организм после его смерти и, как правило, приводящие к контаминации (загрязнению) образца древней ДНК своими ДНК-фрагментами. Кроме того, туда не попадает ДНК современных людей, например, археологов и антропологов, описывающих находки. Несомненно, загрязнение современной ДНК мешает дальнейшему анализу: во-первых, при амплификации полимераза будет предпочтительнее «работать» с современными бактериальными молекулами ДНК, обходя стороной побитые временем фрагменты древней ДНК, а во-вторых, впоследствии вам придется фильтровать свои данные от всяких ненужных ни вам, ни высокорейтинговым журналам засоров.

Кроме «битвы» с контаминацией и борьбы за стерильные лабораторные условия, палеогенетики сталкиваются и с другими серьёзными проблемами. Например, с фрагментацией геномной и митохондриальной ДНК. Причем фрагменты в лучшем случае оказываются около 100 нуклеотидов. Мне встречалось немало людей, утверждавших, что их образцы обладают прекрасной сохранностью, но на деле они говорили о прекрасной сохранности современной ДНК, засорившей их образцы...

Следует отметить, что в некоторых случаях археологические останки действительно могут содержать десятки процентов эндогенной ДНК, но зачастую ученые вынуждены работать с долями процентов — плевелами среди куч современного «генетического мусора». Например, в костных останках денисовского человека было обнаружено примерно 70% эндогенной ДНК [3–5], а при анализе митохондриального генома новосвободненского человека этот показатель составил 0,006%, что говорит о диаметрально отличных условиях внешней среды, в которых находился археологический материал.

Естественно, 100 нуклеотидов — это ещё не повод «посыпать голову пеплом», ведь таких кусочков может быть тысячи и миллионы. Только следует помнить, что ДНК, как и любая биомолекула, способна вступать в химические реакции с окружающим миром, тут-то и появляются различные модификации нуклеотидов (особенно по краям фрагментов древней ДНК). Наиболее частая постмортальная мутация — дезаминирование цитозинов (C), приводящая к возникновению урацилов (U) в последовательности древней ДНК, которые при проведении ПЦР многократно копируются «бездушным» ферментом ДНК-полимеразой как тимин (Т). Считается, что интенсивность процессов дезаминирования зависит от условий среды, в которой находятся биологические останки, например, от pH и химического состава почв, влажности и температуры. Под влиянием этих факторов фрагменты древней ДНК расплетаются по краям и отдаются во власть химической модификации.

Итак, фрагменты древней ДНК, с трудом и валидолом выделенные из условной фаланги условного человека, попадают в пробирку, где над ними продолжают «колдовать» палеогенетики. Эти крохи генетической информации, этот «привет из прошлого» подготавливается для дальнейшего секвенирования (установления первичной последовательности ДНК)*. Для этой цели используют современные приборы — секвенаторы, позволяющие прочитать и обработать громадный массив геномной информации за сравнительно небольшой отрезок времени.

Как хорошо уметь считать!

После запуска этих машин и получения первичных, «сырых» данных палеогенетики молитвенно складывают руки, ожидая результатов, которые будут получены группой людей, объединенных специальностью биоинформатика [10, 11]. Именно биоинформатики являются последним звеном при работе с древней ДНК, извлеченной из археологического или палеонтологического материала.

Между нами, эта их особенность дает им уверенность в своем превосходстве над остальными звеньями научного эксперимента, что часто ведет к торможению многих блестящих научных проектов. Однако с этим приходится мириться, поскольку современная популяционная генетика невозможна без использования биоинформатических методов, и на Западе это десятки людей, связанных одной целью. Обработка данных секвенирования древней ДНК — не самое тривиальное занятие: несмотря на значительные усилия, в данных по-прежнему остается большой процент современной ДНК, а также неидентифицируемого генетического мусора, который нуждается в тщательной очистке, с привлечением математического аппарата. Удивительно, но именно постмортальные модификации нуклеотидных последовательностей древней ДНК и небольшая длина выделенных из биологического материала ДНК-фрагментов служат превосходным маркером при работе с древней ДНК, позволяя отфильтровать весь современный генетический мусор [12] (рис. 3).

Рисунок 3. Тест на контаминацию современным генетическим материалом [12].

Фактически фильтрация данных древней ДНК — наиболее важная часть биоинформатической работы: именно на этой стадии отсекаются все те последовательности, которые впоследствии могут привести к научной ошибке. Далее следуют стандартные этапы по определению митохондриальных гаплогрупп, Y-хромосомных гаплотипов, поиску древних геномных мутаций и даже сборке нового генома (например, используя уже известные геномы современных людей в качестве «каркаса»).

Древние перспективы

Идеальные случаи, связанные с превосходной сохранностью археологического материала, приводят к тому, что условная фаланга пальца или бедренная кость, найденные где-то в Сибири, становятся прорывом в понимании истории человечества, заставляющим пересмотреть всю его историю или даже опровергнуть казавшуюся незыблемой теорию его происхождения.

Такие находки и такие исследования приводят к появлению не только великолепных научных публикаций, но и позволяют зародить надежду на возрождение прошлого. Увы, современные естественнонаучные методы позволяют лишь приподнять занавесь древней истории нашей планеты, но воскресить его вряд ли смогут.

Post Scriptum

К сожалению, в России подобные исследования находятся в зачаточном состоянии. Только несколько лабораторий пытаются работать с отечественным палеонтологическим и археологическим материалом, который подобно углеводородам уходит за рубеж. В 2014 году сотрудники Центра «Биоинженерия» РАН и НИЦ «Курчатовский институт» впервые в России отсеквенировали последовательность митохондриальной ДНК (и определили её гаплогруппу) у древнего человека, обитавшего на территории Северного Кавказа в эпоху ранней бронзы [12, 13]. Эта пионерская для России работа, возможно, даст толчок отечественной археологической и палеогенетике.

1. Мамонты, кости и лекарственная устойчивость: новые технологии позволяют изучать эволюцию возбудителей инфекционных заболеваний;
2. Это чума;
3. Meyer M., Kircher M., Gansauge M.T., Li H., Racimo F., Mallick S., et al. (2012). A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science 338, 222–226;;
4. Prüfer K., Racimo F., Patterson N., Jay F., Sankararaman S., Sawyer S. et al. (2014). The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains. Nature 505, 43–49;;
5. Fu Q., Li H., Moorjani P., Jay F., Slepchenko S.M., et al. (2014). Genome sequence of a 45,000-year-old modern human from western Siberia. Nature 514, 445–449;;
6. Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии;
7. Огурцы-убийцы, или как встретились Джим Уотсон и Гордон Мур;
8. Код жизни: прочесть не значит понять;
9. 454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК);
10. Я б в биоинформатики пошёл, пусть меня научат!;
11. Вычислительное будущее биологии;
12. Nedoluzhko A.V., Boulygina E.S., Sokolov A.S., Tsygankova S.V., Gruzdeva N.M., Rezepkin A.D., Prokhortchouk E.B. (2014). Analysis of the Mitochondrial Genome of a Novosvobodnaya Culture Representative using Next-Generation Sequencing and Its Relation to the Funnel Beaker Culture. Acta Naturae 6, 31–35;;
13. Недолужко Артем. (2014). «Путешествие в Денисову пещеру»..

biomolecula.ru

Древняя ДНК Википедия

Секвенирование древней ДНК — определение нуклеотидной последовательности (секвенирование, от лат. sequentum — последовательность) применительно к молекулам ДНК, извлечённым из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных секвенированем древней ДНК, позволяют установить филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов[1].

При работе с древней ДНК исследователи сталкиваются со множеством проблем, связанных с сохранностью образцов. ДНК может деградировать с течением времени, химически модифицироваться. Микроорганизмы, участвующие в разложении останков, не только нарушают целостность тканей, но и вносят в образец собственную ДНК, тем самым усложняя процесс выделения древней ДНК и биоинформатического анализа полученных данных. Такие методы, как секвенирование нового поколения и обогащение ДНК-библиотек путём гибридизации позволяют заметно увеличить количество получаемых из образцов информации.

Проведен анализ ДНК ряда древних животных, в том числе мамонта и пещерного медведя. Анализ ДНК из человеческих останков позволил выделить новую группу древних людей — денисовцев, а также выявить детали происхождения современных этнических групп. Ряд открытий был сделан в результате анализа древней ДНК болезнетворных микроорганизмов: произведен анализ генома чумной палочки из лондонских захоронений XIV века и гриба фитофторы из образцов XIX века.

История

Исследования древней ДНК начались в 1984 году с секвенирования фрагмента митохондриальной ДНК (мтДНК) вымершей во второй половине XIX квагги[2], подвида бурчелловой зебры. Было обнаружено, что ДНК не только сохраняется на протяжении более полутора веков, но также может быть частично выделена и секвенирована. Вскоре после этого Сванте Паабо секвенировал образцы, полученные из человеческих мумий.[3][4] В этих исследованиях ученый использовал бактериальное клонирование для амплификации фрагментов ДНК. Оказалось, что большая часть ДНК в образцах имеет бактериальное или грибное происхождение, а поддающаяся амплификации эндогенная ДНК состоит в основном из коротких повреждённых фрагментов многокопийных локусов (например, мтДНК) и составляет малую часть исследованной ДНК. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило амплифицировать даже немногочисленные сохранившиеся фрагменты ДНК и дало толчок к развитию этой области, однако также увеличило чувствительность результатов к контаминации[5].

Области применения

Исследование древней ДНК имеет важное значение для таких областей науки как генетика, палеозоология, палеоэпидемология, антропология (особенно палеоантропология) и археология. Также эта область стала частью методологии палеогенетики.

Анализ древней ДНК может использоваться для оценки эволюционной близости таксономических групп давно вымерших или сильно изменившихся организмов, конретные родственные связи которых выяснить иными способами крайне затруднительно. Особое внимание здесь уделяется областям высокой изменчивости — участкам ДНК, где мутации происходят часто. В частности, это короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Анализ митохондриальной ДНК дает более точную информацию в контексте этого метода, так как митохондриальная ДНК имеет гораздо большее количество копий по сравнению с ядерной ДНК (около 1000 копий митохондриальных ДНК и 2 копии ядерной ДНК на клетку)[6].

Анализ древней ДНК также позволяет устанавливать половую принадлежность скелетных останков представителей видов, женские и мужские особи которых отличаются набором половых хромосом, что особенно важно, когда другие методы, например антропометрия, не могут дать точного ответа[7].

Данный метод находит свое применение и в контексте палеоэпидемологии. Диагностику заболеваний по скелетным останкам и изучение древних пандемий крайне сложно проводить без анализа ДНК возбудителей, сохранившейся в останках больных. Такие исследования стали возможны только в 1990 годах, что позволило прослеживать как эволюцию инфекционных бактериальных штаммов и вирусов, так и их распространение, а также сопоставлять детектируемые по останкам симптомы болезни с современными знаниями о конкретном заболевании[8][9].

Технические сложности

Деградация ДНК

Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли.[10] Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (англ.) (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР[10][5]. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 пар нуклеотидов, причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования древней ДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам[11].

При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет[10][5].

Примесь чужеродной ДНК

Часто вследствие загрязнения, или контаминации, лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК.[1]

Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации[1][5]. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов[5]. Многие археологические образцы, особенно найденные до появления современных молекулярно-биологических методов, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК[1]. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата[5].

В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминирования[12][13]. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК[14]. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации[5].

Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах

Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики[5].

Методы обработки древней ДНК

В качестве источника древней ДНК часто стараются использовать сохранившиеся части тела, не представляющие большого интереса с точки зрения анатомического строения. Из-за описанных выше процессов в большинстве древних образцов содержание интересующей исследователей древней ДНК очень мало — всего около 1 %. Это количество сильно варьирует в зависимости от природы образца. Последние исследования показывают, что значительно больший выход эндогенной ДНК из останков предков человека достигается при выделении материала из зубов и каменистой части височной кости.[15]

Первым шагом является измельчение образца и выделение ДНК. В случае костных остатков используют пескоструйные пистолеты или специализированные дрели для первичной фрагментации. Далее частицы ещё более измельчаются (до порошкообразного состояния) на перемешивающих мельницах. Порошок последовательно обрабатывается набором реагентов и подвергается центрифугированию для очистки ДНК от минералов и прочих примесей[16].

Следующий этап — изготовление ДНК-библиотек и их обогащение путем гибридизации[17]. Непосредственное получение нуклеотидной последовательности осуществляется путем секвенирования нового поколения.

В 2012 году в статье журнала Methods of Molecular Biology были представлены возможные методы выделения древней ДНК из сохранившихся растительных образцов. Как и в случае с древней ДНК животных, палеорастительные образцы доходят в сохранном виде до нашего времени зачастую из-за охлаждения во время масштабных оледенений[18].

«Допотопная» ДНК

«Допотопной» (англ. antediluvian) была названа ДНК старше 1 миллиона лет. Название было предложено в 1993 году Томасом Линдалом (Tomas Lindahl) в обзоре в Nature[19]. В 1990-е годы появились сообщения о секвенировании ДНК, сохранившейся на протяжении миллионов лет в ископаемых остатках растений, костях динозавров и инклюзах в янтаре. Некоторые из этих результатов с большой вероятностью являются следствием контаминации, другие оказались невоспроизводимы.[10][5] Например, в ответ на публикацию в Science о секвенировании фрагмента митохондриальной ДНК из кости динозавра мелового периода (80 млн лет назад), вышли заметки, в одной из которых было указано, что при построении филогенетического дерева последовательность из кости динозавра кластеризуется с человеческой, а не с ортологичным участком из мтДНК птиц или крокодила, что свидетельствует о большой вероятности контаминации[20]; в другой заметке высказывалось предположение[21], что последовательность, приписанная динозавру, — это на самом деле древняя вставка мтДНК в человеческой хромосоме, попавшей в образец[22].

ДНК животных плейстоцена

Хорошо сохранившиеся образцы позволяют частично, а в некоторых случаях даже полностью секвенировать ядерный геном. В 2008 году была секвенирована ДНК, полученная из шерсти двух мамонтов, умерших около 20 и 59 тысяч лет назад. Картирование на черновую сборку генома африканского слона позволило оценить долю эндогенной ДНК в этих образцах в 90 % и 58 % соответственно; большую часть загрязнения в обоих случаях составили бактериальная ДНК и последовательности, происхождение которых определить не удалось. Полученные данные позволили оценить время расхождения между мамонтом и африканским слоном в 7,5 млн лет, а время расхождения между двумя линиями мамонта, для которых были взяты образцы, — в 1,5-2 млн лет. При этом секвенированная ДНК мамонтов совпадает со слоновьей на 99,41 % на нуклеотидном уровне и 99,78 % на аминокислотном уровне (то есть различие составляет примерно 1 остаток на белок). Принадлежность М4 и М25 к разным кладам была установлена ранее на основе секвенирования митохондриальной ДНК, и новая оценка на время расхождения согласуется с оценкой по мтДНК и уточняет последнюю. Одной из целей секвенирования мамонта было определение функционально важных аминокислотных различий между мамонтом и слоном. Были отобраны 92 различия между этими видами, которые могут иметь функциональное значение, и часть из которых, возможно, находилась под положительным отбором[23].

В одном из более ранних исследований в качестве образцов были взяты хорошо сохранившиеся при низких температурах останки восьми мамонтов из Музея мамонта в Хатанге. Для лучшего из отобранных образцов 45,4 % фрагментов ДНК выравнивались на сборку генома слона, при этом сходство между ДНК слона и мамонта составило 98,55 % без поправки на увеличение числа различий из-за дезаминации[24].

В 2013 году была получена черновая версия генома древней лошади[25]. Возраст образца оценивается в 560—780 тысяч лет. По состоянию на конец 2013 года это самый древний полный ядерный геном. Также были секвенированы ДНК лошади из позднего плейстоцена (~43 тысячи лет назад), пяти современных пород лошадей, лошади Пржевальского и осла. Филогенетический анализ показал, что последний общий предок всего рода Лошади жил 4-4,5 миллиона лет назад, что оказалось вдвое больше принятой до того оценки; популяции предков лошади Пржевальского и домашней лошади разошлись 38-72 тысячи лет назад. В том же году была восстановлена последовательность митохондриальной ДНК пещерного медведя из испанской Пещеры Костей, жившего в среднем плейстоцене, 179—680 тыс. лет назад, причём техника подготовки древней ДНК к секвенированию была оптимизирована для лучшего прочтения коротких (30-50 пн) фрагментов[11]. По состоянию на октябрь 2013-го, древний геном отсеквенирован с покрытием больше единицы только для таких позвоночных, как человек, белый медведь и лошадь.

ДНК древних людей

Неандертальцы

Первым шагом в изучении генетического материала неандертальцев была работа с митохондриальной ДНК, выделенной из костей, которые были обнаружены в 1856 году в долине реки Неандерталь (Германия). В 2006 году был начат проект по секвенированию полного генома неандертальца. В работе использовалась ДНК останков из пещеры Виндия в Хорватии, а также из некоторых других костей. Выравнивание полученного генома вместе с геномом современного человека и геномом шимпанзе, позволило грубо оценить время расхождения современного человека и неандертальца в 270—440 тыс. лет в предположении, что человек и шимпанзе разошлись 6,5 млн лет назад[26]. Геномы неандертальцев из пещеры Сидрон (англ.) (Испания), пещеры Фельдхофер (англ.) (Германия), Мезмайской пещеры (Россия) незначительно отличаются от первого.

Секвенирование ДНК древних людей даёт надежду установить функциональные геномные мутации, которые отличают древнего человека от обезьяны, а также проследить отличия современного человека от древних людей. Исследование выявило удивительно малое количество зафиксировавшихся замен в геноме за довольно долгое время. Было найдено всего лишь 5 генов, в которых у современного человека зафиксировалось больше одной замены, меняющей структуру белка (по сравнению с неандертальцем, который в этих локусах совпал с шимпанзе): RPTN (англ.), SPAG17, CAN15, TTF1 (англ.) и PCD16.

Сравнение разнообразия SNP для неандертальцев и современного человека позволяет локализовать мишени положительного отбора в геноме. Самый обширный такой участок генома, выявленный анализом различий SNP, принадлежит гену THADA (англ.), и SNP в ближайшем его окружении ассоциированы с диабетом 2 типа, а экспрессия этого гена существенно различается для больных диабетом и здоровых людей. В этом же регионе была обнаружена вставка 9 нуклеотидов в геноме человека, которая отсутствует у всех известных геномов от мыши до приматов и у неандертальца. Также SNP в других регионах ассоциируются с шизофренией, синдромом Дауна, аутизмом. Интерес представляет ген RUNX2 (англ.), который является единственным известным на данный момент геном, связанным с развитием ключично-черепного дизостоза. Анализ SNP также выявляет примесь генетического материала неандертальцев в ДНК неафриканцев, что подтверждает теорию о скрещивании неандертальцев с современными людьми, произошедшем после выхода популяции последних из Африки.

Денисовцы

Именно анализ древней ДНК позволил обнаружить этот вид древних людей — изначально считалось, что найденные в Денисовой пещере фрагменты скелета (две фаланги пальцев и три коренных зуба) принадлежат неандертальцам. Секвенирование митохондриальной ДНК останков опровергло теорию и показало, что они принадлежат отдельной группе. Различие денисовцев и современных людей в 2 раза превышает различие неандертальцев и современных людей, однако для ядерной ДНК эти различия имеют одинаковый порядок. Возможное объяснение состоит в том, что денисовцы и неандертальцы происходят от общего предка, который ранее отделился от ветви будущего современного человека. Эту гипотезу подтвердило сравнение двух геномов древних людей (денисовец, неандерталец) и пяти геномов современных людей (представителей Франции, Китая, Папуа — Новой Гвинеи, африканских народностей йоруба и бушменов), а также выравнивание геномов денисовцев, неандертальцев и африканцев йоруба на геном шимпанзе. Помимо этого, исследование показало, что денисовцы и неандертальцы являются сестринскими группами. Также было показано, что денисовцы, как и неандертальцы, скрещивались с некоторыми неафриканскими популяциями современных людей: примесь ДНК неандертальцев присутствует во всех неафриканских группах, а примесь денисовцев — у папуасов и меланезийцев[14].

Филогенетические выводы по данным ядерной и митохондриальной ДНК расходятся. Это может объясняться, тем, что мтДНК денисовцев происходит из некой древней линии, которая не прижилась в неандертальцах и современных людях. Большой размер древних популяций делает эту гипотезу правдоподобной, хотя для однозначного разрешения этой проблемы данных пока недостаточно.

Гейдельбергский человек

Анализ практически полного митохондриального генома гейдельбергского человека из Пещеры Костей позволил оценить возраст находки в 150—640 тысяч лет и показал, что митохондриальные геномы более схожи для гейдельбергского человека и денисовцев, чем для указанных видов и неандертальца, хотя по морфологическим признакам люди из Пещеры Костей близки к неандертальцам. Есть несколько возможных объяснений. Люди из Пещеры Костей могут представлять группу, отличную и от неандертальцев, и от денисовцев, которая внесла вклад в денисовскую мтДНК, но эта версия не объясняет морфологических черт неандертальцев у вида, напрямую с ними не связанного. Второе возможное объяснение состоит в том, что гейдельбергские люди относятся к общим предкам неандертальцев и денисовцев, однако эта версия предполагает существование в этой группе двух сильно разошедшихся линий мтДНК, предковых для неандертальцев и денисовцев. В третьих, не исключено влияние малоисследованных подвидов человека, которые могли сделать вклад в мтДНК гейдельберских людей и денисовцев. Анализ ядерной ДНК может прояснить картину[27].

Древняя эпигенетика

Информация о метилировании цитозинов в CpG (англ.) может быть восстановлена непосредственно по данным секвенирования[28]. При дезаминировании, которое происходит случайно с течением времени, неметилированный цитозин превращается в урацил, а метилированный — в тимин. Протокол секвенирования древней ДНК предполагает обработку ДНК урацил-ДНК-гликозилазой и эндонуклеазой VIII, в результате которой урацил удаляется и молекула ДНК раскусывается в соответствующем месте с удалением поврежденного нуклеотида[29]. В результате при секвенировании для тех позиций, где цитозин был метилирован, будет получен большой процент чтений с Т, а неметилированный цитозин прочитается как C по тем молекулам, где дезаминирование в этом месте не произошло.

По последовательности ДНК, извлечённой из волос 4000-летних останков палеоэскимоса удалось построить полногеномную карту расположения нуклеосом и метилирования[30], причём профиль метилирования оказался близок к тому, что наблюдается в волосах современного человека.

Также восстановлена карта метилирования для неандертальцев и денисовцев[28][31]. Их метилом оказался похож на метилом современного человека, особенно в районе генов «домашнего хозяйства», однако найдено около 2000 областей со значимыми отличиями в метилировании. В частности, у древних людей найдены заметилированные участки в кластере HOXD, задействованном в регуляции развития конечностей, что может объяснять такие анатомические различия между ними и современными людьми, как менее длинные конечности, крупные кисти, широкие локтевые и коленные суставы[28][31].

Патогены

Современные методы экстракции и секвенирования древней ДНК позволяют проводить исследования патогенов, полученных из останков давно умерших от болезни людей. Филогенетический анализ полученных образцов позволяет восстанавливать эволюцию болезнетворных организмов. Секвенированы средневековые штаммы чумной палочки и палочки Хансена, а также штамм палочки Коха XIX-го века.

Чумная палочка

Исследования древней ДНК чумной палочки (Yersinia pestis), полученных из лондонских захоронений жертв «Чёрной смерти» установили, что чумная палочка того времени, если не считать возможных геномных перестроек, характерных для этого вида, и ограничиться однонуклеотидными полиморфизмами, мало отличалась от современных штаммов. Более того, для всех полиморфизмов, отличающих её от современного штамма, в ней присутствовал вариант предка чумной палочки — Y. pseudotuberculosis. Эти данные позволяют предполагать, что генотип древней чумной палочки не являлся главной причиной её высокой вирулентности в то время и, возможно, его вклад был наравне с вкладом таких факторов, как генетически обусловленная восприимчивость носителей, климат, социальные условия, взаимодействия с другими болезнями. При помощи филогенетического анализа был установлен временной интервал, в который жил последний общий предок всех современных патогенных для человека штаммов чумной палочки: 1282—1343 года, причём древняя бактерия оказалась ближе всего к предковому узлу филогенетического дерева[32].

Фитофтора

В 2013 году было опубликовано показательное исследование в области секвенирования старых патогенов, посвященное не существующим ныне штаммам фитофторы (Phytophthora infestans), которые вызвали Ирландский картофельный голод в середине XIX века. Генетический материал этих патогенов был выделен из сохраненных листьев картофеля и томата разного времени. До настоящего времени, ввиду отсутствия методов секвенирования, анализ данных был невозможен. Ученые провели анализ разных штаммов патогенов, выделив родственные штаммы из растений в Ирландии, Северной Америки и Европы. Исследования показали, что группа штаммов вызвавшая вышеупомянутый голод (HERB-1) и Северо-Американская группа (US-1) имели последнего общего предка предположительно на территории Мексики на рубеже XVIII и XIX веков.

Это исследование особенно интересно с точки зрения подходов к анализу древней ДНК возбудителей прошедших эпидемий как животных, так и растений. Данная область находится на раннем этапе своего развития, однако в случае систематического создания биологических банков, подобные знания могут значительно способствовать ускоренному поиску противомикробных препаратов в ближайшем будущем, в случае возникновения эпидемий, вызванных родственными возбудителями[33].

См. также

Примечания

1. ↑ 1 2 3 4 B. Shapiro, M. Hofreiter (24 January 2014). «A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA». Science 343 no. 6169: 3—16. DOI:10.1126/science.1236573.
2. ↑ Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 312, no. 5991. — P. 282—284. — DOI:10.1038/312282a0. — PMID 6504142.
3. ↑ Pääbo S. Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 314, no. 6062. — P. 644—645. — DOI:10.1038/314644a0. — PMID 3990798.
4. ↑ Pääbo S. Molecular genetic investigations of ancient human remains (англ.) // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. — 1986. — Vol. 51, no. Pt 1. — P. 441—446. — PMID 3107879.
5. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Eske Willerslev and Alan Cooper (January 2005). «Review Paper. Ancient DNA». Proc. R. Soc. B 272 no. 1558: 3—16. DOI:10.1098/rspb.2004.2813.
6. ↑ Ermanno Rizzi, Martina Lari, Elena Gigli, Gianluca De Bellis, David Caramelli Ancient DNA studies: new perspectives on old samples (En) // Genetics Selection Evolution. — 2012/12. — Т. 44, вып. 1. — С. 21. — ISSN 1297-9686. — DOI:10.1186/1297-9686-44-21.
7. ↑ Pontus Skoglund, Jan Storå, Anders Götherström, Mattias Jakobsson Accurate sex identification of ancient human remains using DNA shotgun sequencing // Journal of Archaeological Science. — Т. 40, вып. 12. — С. 4477–4482. — DOI:10.1016/j.jas.2013.07.004.
8. ↑ Adrian M. Whatmore Ancient-Pathogen Genomics: Coming of Age? (англ.) // mBio. — 2014-10-31. — Vol. 5, iss. 5. — P. e01676–14. — ISSN 2150-7511. — DOI:10.1128/mbio.01676-14.
9. ↑ Zoe Patterson Ross, Jennifer Klunk, Gino Fornaciari, Valentina Giuffra, Sebastian Duchêne The paradox of HBV evolution as revealed from a 16th century mummy (англ.) // PLOS Pathogens. — 2018-01-04. — Vol. 14, iss. 1. — P. e1006750. — ISSN 1553-7374. — DOI:10.1371/journal.ppat.1006750.
10. ↑ 1 2 3 4 Michael Hofreiter, David Serre, Hendrik N. Poinar, Melanie Kuch and Svante Pääbo (2001). «Ancient DNA». Nature Reviews Genetics 2: 353—359. DOI:10.1038/35072071.
11. ↑ 1 2 Jesse Dabney et al. (06.08.2013). «Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments». PNAS (201314445): 15758—15763. DOI:10.1073/pnas.1314445110. ISSN 0027-8424.
12. ↑ Pontus Skoglund, Bernd H. Northoff, Michael V. Shunkov, Anatoli P. Derevianko, Svante Pääbo, Johannes Krause, and Mattias Jakobsson. (11 February 2014). «Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal». Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 111 no. 6: 2229—2234. DOI:10.1073/pnas.1318934111.
13. ↑ Этот метод требует наличия референсного генома. В первом приближении метод выглядит следующим образом. Чтения выравниваются на геном, после чего рассматриваются позиции, где встречаются, например, цитозин и тимин. Сравниваются две модели: одна предполагает, что замена цитозина на тимин произошла в результате посмертной деградации ДНК, вторая предполагает, что это полиморфизм или ошибка секвенирования. Модель выбирается по методу максимального правдоподобия.
14. ↑ 1 2 David Reich et al. (23/30 December 2010). «Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia». Nature vol. 468: 1053—1060. DOI:10.1038/nature09710.
15. ↑ Henrik B. Hansen, Peter B. Damgaard, Ashot Margaryan, Jesper Stenderup, Niels Lynnerup Comparing Ancient DNA Preservation in Petrous Bone and Tooth Cementum (англ.) // PLOS ONE. — 2017-01-27. — Vol. 12, iss. 1. — P. e0170940. — ISSN 1932-6203. — DOI:10.1371/journal.pone.0170940.
16. ↑ Jesse Dabney, Michael Knapp, Isabelle Glocke, Marie-Theres Gansauge, Antje Weihmann Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013-09-24. — Vol. 110, iss. 39. — P. 15758–15763. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — DOI:10.1073/pnas.1314445110.
17. ↑ Iosif Lazaridis, Dani Nadel, Gary Rollefson, Deborah C. Merrett, Nadin Rohland Genomic insights into the origin of farming in the ancient Near East (En) // Nature. — 2016/08. — Т. 536, вып. 7617. — С. 419–424. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature19310.
18. ↑ Beth Shapiro and Michael Hofreiter (eds.). Ancient DNA: Methods and Protocols. — Methods in Molecular Biology. — © Springer Science+Business Media, LLC 2012. — С. vol. 840. — ISBN DOI 10.1007/978-1-61779-516-9_10.
19. ↑ Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA (англ.) // Nature. — 1993. — Vol. 362, no. 6422. — P. 709—715. — DOI:10.1038/362709a0. — PMID 8469282.
20. ↑ S. Blair Hedges, Mary H. Schweitzer (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1191—1192. DOI:10.1126/science.7761839.
21. ↑ В то время сборки человеческого генома ещё не существовало. См. Проект «Геном человека»
22. ↑ Zischler H., Höss M., Handt O., von Haeseler A., van der Kuyl A.C., Goudsmit J. (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1193—4. DOI:10.1126/science.7605504.
23. ↑ Web Miller et al. (20 november 2008). «Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth». Nature vol. 456: 387—392. DOI:10.1038/nature07446.
24. ↑ Hendrik N. Poinar et al. (20 January 2006). «Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA». Science vol. 311: 392—394. DOI:10.1126/science.1123360.
25. ↑ Ludovic Orlando et al. (26 June 2013). «Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse». Nature vol. 499: 74—78. DOI:10.1038/nature12323.
26. ↑ Richard E. Green et al. (7 May 2010). «A Draft Sequence of the Neandertal Genome». Science vol. 328: 710—722. DOI:10.1126/science.1188021.
27. ↑ Matthias Meyer et al. (16 January 2014). «A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos». Nature 505: 403—406. DOI:10.1038/nature12788.
28. ↑ 1 2 3 Elizabeth Pennisi (18 April 2014). «Ancient DNA Holds Clues to Gene Activity in Extinct Humans». Science Vol. 344 no. 6181: pp. 245-246. DOI:10.1126/science.344.6181.245.
29. ↑ Briggs et al. (22 Dec 2009). «Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA». Nucl. Acids Res. Vol. 38 (6): pp. e87. DOI:10.1093/nar/gkp1163.
30. ↑ Jakob Skou Pedersen et al. (3 December 2013). «Genome-wide nucleosome map and cytosine methylation levels of an ancient human genome». Genome Res 24: 454—466. DOI:10.1101/gr.163592.113.
31. ↑ 1 2 David Gokhman, Eitan Lavi, Kay Prüfer, Mario F. Fraga, José A. Riancho, Janet Kelso, Svante Pääbo, Eran Meshorer, Liran Carmel (April 17 2014). «Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan». Science Published Online. DOI:10.1126/science.1250368.
32. ↑ Kirsten I. Bos, Verena J. Schuenemann, G. Brian Golding, Hernán A. Burbano, Nicholas Waglechner A draft genome of Yersinia pestis from victims of the Black Death (En) // Nature. — 2011/10. — Т. 478, вып. 7370. — С. 506–510. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature10549.
33. ↑ Kentaro Yoshida Verena J Schuenemann Liliana M Cano Marina Pais Bagdevi Mishra Rahul Sharma Chirsta Lanz Frank N Martin Sophien Kamoun Johannes Krause Marco Thines Detlef Weigel Hernán A Burbano The rise and fall of the Phytophthora infestans lineage that triggered the Irish potato famine (англ.) // eLife : Published online. — 2013. — Май.

Литература

wikiredia.ru

Наука: Наука и техника: Lenta.ru

Ученые смогли расшифровать ядерную ДНК человека из останков, обнаруженных в испанском могильнике Расщелина костей (Sima de los Huesos). Оказалось, что захороненные там люди, жившие 430 тысяч лет назад, были ближе к неандертальцам, чем к денисовцам, — притом, что в их ДНК нашли следы обеих групп древних людей. Новое исследование представлено в журнале Nature.

Обнаруженные в Расщелине костей в горах Сьерра-де-Атапуэрка кости изначально классифицировали как относящиеся к гейдельбергскому человеку (жил в Евразии от 600 до 250 тысяч лет назад). Этот вид считается предком неандертальцев, а некоторые исследователи относят его к предкам и современных людей. Однако в 2013 году митохондриальная ДНК (мтДНК) останков показала много общего с мтДНК денисовцев — другого вида людей, о которых антропологам почти ничего не известно (кроме того, что жили они на востоке и юго-востоке Евразии).

Материалы по теме

09:06 — 20 июня 2014

Главное — зубы

Черепа из Атапуэрки пролили свет на эволюцию неандертальцев

08:48 — 6 июня 2015

Палеогенетики из Германии смогли секвенировать ядерную ДНК: они извлекли достаточно материала из зуба и одной из костей ноги — несмотря на то, что древняя ДНК разложилась на короткие фрагменты. Оказалось, что гоминины из Расщелины костей ближе к неандертальцам, чем к денисовцам. Таким образом, эти группы Homo разошлись уже 430 тысяч лет назад — значительно раньше, чем считали генетики.

Кроме того, это открытие отодвигает в прошлое срок отделения предков Homo sapiens от неандертальцев и денисовцев — до 765 тысяч лет назад. Ранее ученые полагали, что это событие произошло в промежутке 315-540 тысяч лет назад. Однако данные испанской ДНК, помимо всего прочего, лучше согласуются с последними датировками ископаемых останков древних людей.

На следующем этапе открытие немецких палеогенетиков приведет к перечерчиванию всего эволюционного древа рода Homo. В настоящее время во всех учебниках написано, что Homo sapiens, неандертальцы и денисовцы произошли от гейдельбергского человека. Однако последний оформился в отдельный вид лишь 700 тысяч лет назад. Теперь получается, что последний общий предок трех видов — это не Homo heidelbergensis, а более древний и загадочный вид Homo antecessor, который впервые появляется более миллиона лет назад.

Ученые отмечают, что останки из Расщелины костей еще не раскрыли всех своих тайн. Например, митохондриальная ДНК у них ближе к денисовской. Это можно объяснить наличием неизвестной ветви евразийских гоминин, которые скрещивались с общими предками неандертальцев и денисовцев — но не с представителями группы, которые впоследствии стали чистыми неандертальцами. Или же «испанская» мтДНК была характерна для всех этих архаичных гоминин, и лишь затем неандертальцы получили иную мтДНК из африканской популяции предков Homo sapiens.

lenta.ru

Секвенирование древней ДНК — википедия орг

Секвенирование древней ДНК (aDNA, дДНК) — это секвенирование ДНК, извлечённой из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. Исследования нуклеотидных последовательностей, полученных путем секвенирования древней ДНК, позволяют устанавливать филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов[1].

При работе с древней ДНК исследователи сталкиваются со множеством проблем, связанных с сохранностью образцов. ДНК может деградировать с течением времени, химически модифицироваться. Такие методы как секвенирование нового поколения и обогащение ДНК-библиотек путем гибридизации позволяют заметно увеличить количество получаемых из образцов информации. В настоящее время возможно извлечение и анализ ДНК таких давно вымерших биологических видов, как, например, мамонты, неандертальцы или древние патогенные бактерии.

История

Исследования древней ДНК начались в 1984 году с секвенирования фрагмента митохондриальной ДНК квагги[2], подвида бурчелловой зебры, вымершего во второй половине XIX века. Было обнаружено, что ДНК не только сохраняется на протяжении более полутора века, но также может быть частично выделена и секвенирована. Вскоре после этого Сванте Паабо секвенировал образцы, полученные из человеческих мумий.[3][4] Эти исследования использовали бактериальное клонирование для амплификации фрагментов ДНК. Оказалось, что большая часть ДНК в образцах имеет бактериальное или грибное происхождение, а поддающаяся амплификации эндогенная ДНК состоит в основном из коротких повреждённых фрагментов многокопийных локусов (например, мтДНК) и составляет малую часть исследованной ДНК. Изобретение ПЦР позволило амплифицировать даже немногочисленные сохранившиеся фрагменты ДНК и дало толчок к развитию этой области, однако также увеличило чувствительность результатов к контаминации[5].

Области применения

Исследование древней ДНК имеет важное значение для таких областей науки как генетика, палеозоология, палеоэпидемология, антропология (особенно палеоантропология) и археология. От последней развилась отдельная отрасль науки — палеогенетика.

Анализ древней ДНК может использоваться для оценки эволюционной близости таксономических групп давно вымерших или сильно изменившихся организмов, конретные родственные связи которых выяснить иными способами крайне затруднительно. Особое внимание здесь уделяется областям высокой изменчивости — участкам ДНК, где мутации происходят часто. В частности, это короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Особенно перспективным является анализ митохондриальной ДНК, так как она имеет гораздо большее количество копий по сравнению с ядерной ДНК (около 1000 копий митохондриальных ДНК и 2 копии ядерной ДНК на клетку)[6].

Анализ древней ДНК также позволяет устанавливать половую принадлежность скелетных останков представителей видов, женские и мужские особи которых отличаются набором половых хромосом, что особенно важно, когда другие методы, например антропометрия, не могут дать точного ответа[7].

Значимый интерес вызывает дДНК и в контексте палеоэпидемологии. Диагностику заболеваний по скелетным останкам и изучение древних пандемий крайне сложно проводить без анализа ДНК возбудителей, сохранившейся в останках больных. Такие исследования стали возможны только в 1990 годах. В ближайшие годы основное внимание будет уделяться обнаружению возможных вымерших инфекционных бактериальных штаммов, а также сопоставлению детектируемых по останкам симптомов болезни с современными знаниями о конкретном заболевании. С увеличением количества данных изучение дДНК может внести важный вклад в историческую эпидемиологию в будущем[8].

Технические сложности

Деградация ДНК

Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли.[9] Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (англ.) (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР[9][5]. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 п.н., причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования дДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам[10].

При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет[9][5].

Примесь чужеродной ДНК

Часто вследствие загрязнения, или контаминации, лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК.[1]

Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации[1][5]. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов. Хорошим способом убедиться (и убедить научное сообщество) в истинности результатов является повторение исследования в другой лаборатории[5]. Многие археологические образцы, особенно найденные давно, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК[1]. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата[5].

В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминирования[11]. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК[12]. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации[5].

Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах

Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики[5].

Методы обработки древней ДНК

В качестве источника древней ДНК часто стараются использовать сохранившиеся части тела, не представляющие большого интереса с точки зрения анатомического строения. Из-за описанных выше процессов в большинстве древних образцов содержание интересующей исследователей древней ДНК очень мало — всего около 1 %. Это количество сильно варьирует в зависимости от природы образца. Последние исследования показывают, что значительно больший выход эндогенной ДНК из останков предков человека достигается при выделении материала из зубов и каменистой части височной кости.[13]

Первым шагом является измельчение образца и выделение ДНК. В случае костных остатков используют пескоструйные пистолеты или специализированные дрели для первичной фрагментации. Далее частицы ещё более измельчаются(до порошкообразного состояния) на перемешивающих мельницах. Порошок последовательно обрабатывается набором реагентов и подвергается центрифугированию для очистки ДНК от минералов и прочих примесей[14].

Следующий этап — изготовление ДНК-библиотек и их обогащение путем гибридизации[15]. Непосредственное получение нуклеотидной последовательности осуществляется путем секвенирования нового поколения.

В 2012 году в статье журнала Methods of Molecular Biology были представлены возможные методы выделения древней ДНК из сохранившихся растительных образцов. Как и в случае с древней ДНК животных, палеорастительные образцы доходят в сохранном виде до нашего времени зачастую из-за охлаждения во время масштабных оледенений[16].

«Допотопная» ДНК

«Допотопной» (англ. antediluvian) была названа ДНК старше 1 миллиона лет. Название было предложено в 1993 году Томасом Линдалом (Tomas Lindahl) в обзоре в Nature[17]. В 90-е годы появились сообщения о секвенировании ДНК, сохранившейся на протяжении миллионов лет в ископаемых остатках растений, костях динозавров и инклюзах в янтаре. Некоторые из этих результатов с большой вероятностью являются следствием контаминации, другие оказались невоспроизводимы.[9][5] Например, в ответ на публикацию в Science о секвенировании фрагмента митохондриальной ДНК из кости динозавра мелового периода (80 млн лет назад), вышли заметки, в одной из которых было указано, что при построении филогенетического дерева последовательность из кости динозавра кластеризуется с человеческой, а не с ортологичным участком из мтДНК птиц или крокодила, что свидетельствует о большой вероятности контаминации[18]; в другой заметке высказывалось предположение[19], что последовательность, приписанная динозавру, — это на самом деле древняя вставка мтДНК в человеческой хромосоме, попавшей в образец[20].

ДНК животных плейстоцена

Хорошо сохранившиеся образцы позволяют частично, а в некоторых случаях даже полностью секвенировать ядерный геном. В 2008 году была секвенирована ДНК, полученная из шерсти двух мамонтов, умерших около 20 и 59 тысяч лет назад. Картирование на черновую сборку генома африканского слона позволило оценить долю эндогенной ДНК в этих образцах в 90 % и 58 % соответственно; большую часть загрязнения в обоих случаях составили бактериальная ДНК и последовательности, происхождение которых определить не удалось. Полученные данные позволили оценить время расхождения между мамонтом и африканским слоном в 7,5 млн лет, а время расхождения между двумя линиями мамонта, для которых были взяты образцы, — в 1,5-2 млн лет. При этом секвенированная ДНК мамонтов совпадает со слоновьей на 99,41 % на нуклеотидном уровне и 99,78 % на аминокислотном уровне (то есть различие составляет примерно 1 остаток на белок). Принадлежность М4 и М25 к разным кладам была установлена ранее на основе секвенирования митохондриальной ДНК, и новая оценка на время расхождения согласуется с оценкой по мтДНК и уточняет последнюю. Одной из целей секвенирования мамонта было определение функционально важных аминокислотных различий между мамонтом и слоном. Были отобраны 92 различия между этими видами, которые могут иметь функциональное значение, и часть из которых, возможно, находилась под положительным отбором[21].

В одном из более ранних исследований в качестве образцов были взяты хорошо сохранившиеся при низких температурах останки восьми мамонтов из Музея мамонта в Хатанге. Для лучшего образца 45,4 % фрагментов ДНК выравнивались на сборку генома слона, при этом сходство между ДНК слона и мамонта составило 98,55 % без поправки на увеличение числа различий из-за дезаминации[22].

В 2013 году была получена черновая версия генома древней лошади[23]. Возраст образца оценивается в 560—780 тысяч лет. По состоянию на конец 2013 года это самый древний полный ядерный геном. Также были секвенированы ДНК лошади из позднего плейстоцена (~43 тысячи лет назад), пяти современных пород лошадей, лошади Пржевальского и осла. Филогенетический анализ показал, что последний общий предок всего рода Лошади жил 4-4,5 миллиона лет назад, что оказалось вдвое больше принятой до того оценки; популяции предков лошади Пржевальского и домашней лошади разошлись 38-72 тысячи лет назад. В том же году была восстановлена последовательность митохондриальной ДНК пещерного медведя из испанской Пещеры Костей, жившего в среднем плейстоцене, 179—680 тыс. лет назад, причём техника подготовки дДНК к секвенированию была оптимизирована для лучшего прочтения коротких (30-50 пн) фрагментов[10]. По состоянию на октябрь 2013-го, древний геном отсеквенирован с покрытием больше единицы только для таких позвоночных, как человек, белый медведь и лошадь.

ДНК древних людей

Неандертальцы

На данный момент в европейской части Евразии найдено множество останков неандертальцев. Первым шагом в изучении их генетического материала была работа с митохондриальной ДНК, выделенной из костей, которые были обнаружены в 1856 году в долине реки Неандерталь (Германия). В 2006 году был начат проект по секвенированию полного генома неандертальца. В работе использовалась ДНК останков из пещеры Виндия в Хорватии, а также из некоторых других костей. Выравнивание полученного генома вместе с геномом современного человека и геномом шимпанзе, позволило грубо оценить время расхождения современного человека и неандертальца в 270—440 тыс. лет в предположении, что человек и шимпанзе разошлись 6,5 млн лет назад[24]. Геномы неандертальцев из пещеры Сидрон (англ.) (Испания), пещеры Фельдхофер (англ.) (Германия), Мезмайской пещеры (Россия) незначительно отличаются от первого.

Секвенирование ДНК древних людей даёт надежду установить функциональные геномные мутации, которые отличают древнего человека от обезьяны, а также проследить отличия современного человека от древних людей. Исследование выявило удивительно малое количество зафиксировавшихся замен в геноме за довольно долгое время. Было найдено всего лишь 5 генов, в которых у современного человека зафиксировалось больше одной замены, меняющей структуру белка (по сравнению с неандертальцем, который в этих локусах совпал с шимпанзе): RPTN (англ.), SPAG17, CAN15, TTF1 (англ.) и PCD16.

Сравнение разнообразия SNP для неандертальцев и современного человека позволяет локализовать мишени положительного отбора в геноме. Самый обширный такой участок генома, выявленный анализом различий SNP, принадлежит гену THADA (англ.), и SNP в ближайшем его окружении ассоциированы с диабетом 2 типа, а экспрессия этого гена существенно различается для больных диабетом и здоровых людей. В этом же регионе была обнаружена вставка 9 нуклеотидов в геноме человека, которая отсутствует у всех известных геномов от мыши до приматов и у неандертальца. Также SNP в других регионах ассоциируются с шизофренией, синдромом Дауна, аутизмом. Интерес представляет ген RUNX2 (англ.), который является единственным известным на данный момент геном, связанным с развитием ключично-черепного дизостоза. Анализ SNP также выявляет примесь генетического материала неандертальцев в ДНК неафриканцев, что подтверждает теорию о скрещивании неандертальцев с современными людьми, произошедшем после выхода популяции последних из Африки.

Денисовцы

Именно анализ древней ДНК позволил обнаружить этот вид древних людей — изначально считалось, что найденные в Денисовой пещере фрагменты скелета (две фаланги пальцев и три коренных зуба) принадлежат неандертальцам. Секвенирование митохондриальной ДНК останков опровергло теорию и показало, что они принадлежат отдельной группе. Различие денисовцев и современных людей в 2 раза превышает различие неандертальцев и современных людей, однако для ядерной ДНК эти различия имеют одинаковый порядок. Возможное объяснение состоит в том, что денисовцы и неандертальцы происходят от общего предка, который ранее отделился от ветви будущего современного человека. Эту гипотезу подтвердило сравнение двух геномов древних людей (денисовец, неандерталец) и пяти геномов современных людей (представителей Франции, Китая, Папуа — Новой Гвинеи, африканских народностей Йоруба и Бушменов), а также выравнивание геномов денисовцев, неандертальцев и африканцев Йоруба на геном шимпанзе. Помимо этого, исследование показало, что денисовцы и неандертальцы являются сестринскими группами. Также было показано, что денисовцы, как и неандертальцы, скрещивались с некоторыми неафриканскими популяциями современных людей: примесь ДНК неандертальцев присутствует во всех неафриканских группах, а примесь денисовцев — у папуасов и меланезийцев.[12].

Филогенетические выводы по данным ядерной и митохондриальной ДНК расходятся. Это может объясняться, тем, что мтДНК денисовцев происходит из некой древней линии, которая не прижилась в неандертальцах и современных людях. Большой размер древних популяций делает эту гипотезу правдоподобной, хотя для однозначного разрешения этой проблемы данных пока недостаточно.

Гейдельбергский человек

Анализ практически полного митохондриального генома гейдельбергского человека из Пещеры Костей позволил оценить возраст находки в 150—640 тысяч лет и показал, что митохондриальные геномы более схожи для гейдельбергского человека и денисовцев, чем для указанных видов и неандертальца, хотя по морфологическим признакам люди из Пещеры Костей близки к неандертальцам. Есть несколько возможных объяснений. Люди из Пещеры Костей могут представлять группу, отличную и от неандертальцев, и от денисовцев, которая внесла вклад в денисовскую мтДНК, но эта версия не объясняет морфологических черт неандертальцев у вида, напрямую с ними не связанного. Второе возможное объяснение состоит в том, что гейдельбергские люди относятся к общим предкам неандертальцев и денисовцев, однако эта версия предполагает существование в этой группе двух сильно разошедшихся линий мтДНК, предковых для неандертальцев и денисовцев. В третьих, не исключено влияние малоисследованных подвидов человека, которые могли сделать вклад в мтДНК гейдельберских людей и денисовцев. Анализ ядерной ДНК может прояснить картину[25].

Древняя эпигенетика

Информация о метилировании цитозинов в CpG (англ.) может быть восстановлена непосредственно по данным секвенирования[26]. При дезаминировании, которое происходит случайно с течением времени, неметилированный цитозин превращается в урацил, а метилированный — в тимин. Протокол секвенирования древней ДНК предполагает обработку ДНК урацил-ДНК-гликозилазой и эндонуклеазой VIII, в результате которой урацил удаляется и молекула ДНК раскусывается в соответствующем месте с удалением поврежденного нуклеотида[27]. В результате при секвенировании для тех позиций, где цитозин был метилирован, будет получен большой процент чтений с Т, а неметилированный цитозин прочитается как C по тем молекулам, где дезаминирование в этом месте не произошло.

По последовательности ДНК, извлечённой из волос 4000-летних останков палеоэскимоса удалось построить полногеномную карту расположения нуклеосом и метилирования[28], причём профиль метилирования оказался близок к тому, что наблюдается в волосах современного человека.

Также восстановлена карта метилирования для неандертальцев и денисовцев[26][29]. Их метилом оказался похож на метилом современного человека, особенно в районе генов «домашнего хозяйства», однако найдено около 2000 областей со значимыми отличиями в метилировании. В частности, у древних людей найдены заметилированные участки в кластере HOXD, задействованном в регуляции развития конечностей, что может объяснять такие анатомические различия между ними и современными людьми, как менее длинные конечности, крупные кисти, широкие локтевые и коленные суставы[26][29].

Патогены

Современные методы экстракции и секвенирования древней ДНК позволяют проводить исследования патогенов, полученных из останков давно умерших от болезни людей. Филогенетический анализ полученных образцов позволяет восстанавливать эволюцию болезнетворных организмов. Секвенированы средневековые штаммы чумной палочки и палочки Хансена, а также штамм палочки Коха XIX-го века.

Чумная палочка

Исследования дДНК чумной палочки (Yersinia pestis), полученных из лондонских захоронений жертв «Чёрной смерти» установили, что чумная палочка того времени, если не считать возможных геномных перестроек, характерных для этого вида, и ограничиться однонуклеотидными полиморфизмами, мало отличалась от современных штаммов. Более того, для всех полиморфизмов, отличающих её от современного штамма, в ней присутствовал вариант предка чумной палочки — Y. pseudotuberculosis. Эти данные позволяют предполагать, что генотип древней чумной палочки не являлся главной причиной её высокой вирулентности в то время и, возможно, его вклад был наравне с вкладом таких факторов, как генетически обусловленная восприимчивость носителей, климат, социальные условия, взаимодействия с другими болезнями. При помощи филогенетического анализа был установлен временной интервал, в который жил последний общий предок всех современных патогенных для человека штаммов чумной палочки: 1282—1343 года, причём древняя бактерия оказалась ближе всего к предковому узлу филогенетического дерева[30].

Фитофтора

В 2013 году было опубликовано показательное исследование в области секвенирования старых патогенов, посвященное не существующим ныне штаммам фитофторы (Phytophthora infestans), которые вызвали Великий Картофельный Голод в Ирландии в середине XIX века. Генетический материал этих патогенов был выделен из сохраненных листьев картофеля и томата разного времени. До настоящего времени, ввиду отсутствия методов секвенирования, анализ данных был невозможен. Ученые провели анализ разных штаммов патогенов, выделив родственные штаммы из растений в Ирландии, Северной Америки и Европы. Исследования показали, что группа штаммов вызвавшая вышеупомянутый голод (HERB-1) и Северо-Американская группа (US-1) имели последнего общего предка предположительно на территории Мексики на рубеже XVIII и XIX веков.

Это исследование особенно интересно с точки зрения подходов к анализу дДНК возбудителей прошедших эпидемий как животных, так и растений. Данная область находится на раннем этапе своего развития, однако в случае систематического создания биологических банков, подобные знания могут значительно способствовать ускоренному поиску противомикробных препаратов в ближайшем будущем, в случае возникновения эпидемий, вызванных родственными возбудителями[31].

См. также

Примечания

1. ↑ 1 2 3 4 B. Shapiro, M. Hofreiter (24 January 2014). «A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA». Science 343 no. 6169: 3—16. DOI:10.1126/science.1236573.
2. ↑ Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 312, no. 5991. — P. 282—284. — DOI:10.1038/312282a0. — PMID 6504142.
3. ↑ Pääbo S. Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 314, no. 6062. — P. 644—645. — DOI:10.1038/314644a0. — PMID 3990798.
4. ↑ Pääbo S. Molecular genetic investigations of ancient human remains (англ.) // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. — 1986. — Vol. 51, no. Pt 1. — P. 441—446. — PMID 3107879.
5. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Eske Willerslev and Alan Cooper (January 2005). «Review Paper. Ancient DNA». Proc. R. Soc. B 272 no. 1558: 3—16. DOI:10.1098/rspb.2004.2813.
6. ↑ Ermanno Rizzi, Martina Lari, Elena Gigli, Gianluca De Bellis, David Caramelli Ancient DNA studies: new perspectives on old samples (En) // Genetics Selection Evolution. — 2012/12. — Т. 44, вып. 1. — С. 21. — ISSN 1297-9686. — DOI:10.1186/1297-9686-44-21.
7. ↑ Pontus Skoglund, Jan Storå, Anders Götherström, Mattias Jakobsson Accurate sex identification of ancient human remains using DNA shotgun sequencing // Journal of Archaeological Science. — Т. 40, вып. 12. — С. 4477–4482. — DOI:10.1016/j.jas.2013.07.004.
8. ↑ Adrian M. Whatmore Ancient-Pathogen Genomics: Coming of Age? (англ.) // mBio. — 2014-10-31. — Vol. 5, iss. 5. — P. e01676–14. — ISSN 2150-7511. — DOI:10.1128/mbio.01676-14.
9. ↑ 1 2 3 4 Michael Hofreiter, David Serre, Hendrik N. Poinar, Melanie Kuch and Svante Pääbo (2001). «Ancient DNA». Nature Reviews Genetics 2: 353—359. DOI:10.1038/35072071.
10. ↑ 1 2 Jesse Dabney et al. (9 September 2013). «Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments». PNAS. DOI:10.1073/pnas.1314445110.
11. ↑ Pontus Skoglund, Bernd H. Northoff, Michael V. Shunkov, Anatoli P. Derevianko, Svante Pääbo, Johannes Krause, and Mattias Jakobsson. (11 February 2014). «Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal». Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 111 no. 6: 2229—2234. DOI:10.1073/pnas.1318934111. Этот метод требует наличия референсного генома. В первом приближении метод выглядит следующим образом. Чтения выравниваются на геном, после чего рассматриваются позиции, где встречаются, например, цитозин и тимин. Сравниваются две модели: одна предполагает, что замена цитозина на тимин произошла в результате посмертной деградации ДНК, вторая предполагает, что это полиморфизм или ошибка секвенирования. Модель выбирается по методу максимального правдоподобия.
12. ↑ 1 2 David Reich et al. (23/30 December 2010). «Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia». Nature vol. 468: 1053—1060. DOI:10.1038/nature09710.
13. ↑ Henrik B. Hansen, Peter B. Damgaard, Ashot Margaryan, Jesper Stenderup, Niels Lynnerup Comparing Ancient DNA Preservation in Petrous Bone and Tooth Cementum (англ.) // PLOS ONE. — 2017-01-27. — Vol. 12, iss. 1. — P. e0170940. — ISSN 1932-6203. — DOI:10.1371/journal.pone.0170940.
14. ↑ Jesse Dabney, Michael Knapp, Isabelle Glocke, Marie-Theres Gansauge, Antje Weihmann Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013-09-24. — Vol. 110, iss. 39. — P. 15758–15763. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — DOI:10.1073/pnas.1314445110.
15. ↑ Iosif Lazaridis, Dani Nadel, Gary Rollefson, Deborah C. Merrett, Nadin Rohland Genomic insights into the origin of farming in the ancient Near East (En) // Nature. — 2016/08. — Т. 536, вып. 7617. — С. 419–424. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature19310.
16. ↑ Beth Shapiro and Michael Hofreiter (eds.). Ancient DNA: Methods and Protocols. — Methods in Molecular Biology. — © Springer Science+Business Media, LLC 2012. — С. vol. 840. — ISBN DOI 10.1007/978-1-61779-516-9_10.
17. ↑ Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA (англ.) // Nature. — 1993. — Vol. 362, no. 6422. — P. 709—715. — DOI:10.1038/362709a0. — PMID 8469282.
18. ↑ S. Blair Hedges, Mary H. Schweitzer (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1191—1192. DOI:10.1126/science.7761839.
19. ↑ В то время сборки человеческого генома ещё не существовало. См. Проект «Геном человека»
20. ↑ Zischler H., Höss M., Handt O., von Haeseler A., van der Kuyl A.C., Goudsmit J. (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1193—4. DOI:10.1126/science.7605504.
21. ↑ Web Miller et al. (20 november 2008). «Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth». Nature vol. 456: 387—392. DOI:10.1038/nature07446.
22. ↑ Hendrik N. Poinar et al. (20 January 2006). «Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA». Science vol. 311: 392—394. DOI:10.1126/science.1123360.
23. ↑ Ludovic Orlando et al. (26 June 2013). «Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse». Nature vol. 499: 74—78. DOI:10.1038/nature12323.
24. ↑ Richard E. Green et al. (7 May 2010). «A Draft Sequence of the Neandertal Genome». Science vol. 328: 710—722. DOI:10.1126/science.1188021.
25. ↑ Matthias Meyer et al. (16 January 2014). «A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos». Nature 505: 403—406. DOI:10.1038/nature12788.
26. ↑ 1 2 3 Elizabeth Pennisi (18 April 2014). «Ancient DNA Holds Clues to Gene Activity in Extinct Humans». Science Vol. 344 no. 6181: pp. 245-246. DOI:10.1126/science.344.6181.245.
27. ↑ Briggs et al. (22 Dec 2009). «Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA». Nucl. Acids Res. Vol. 38 (6): pp. e87. DOI:10.1093/nar/gkp1163.
28. ↑ Jakob Skou Pedersen et al. (3 December 2013). «Genome-wide nucleosome map and cytosine methylation levels of an ancient human genome». Genome Res 24: 454—466. DOI:10.1101/gr.163592.113.
29. ↑ 1 2 David Gokhman, Eitan Lavi, Kay Prüfer, Mario F. Fraga, José A. Riancho, Janet Kelso, Svante Pääbo, Eran Meshorer, Liran Carmel (April 17 2014). «Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan». Science Published Online. DOI:10.1126/science.1250368.
30. ↑ Kirsten I. Bos, Verena J. Schuenemann, G. Brian Golding, Hernán A. Burbano, Nicholas Waglechner A draft genome of Yersinia pestis from victims of the Black Death (En) // Nature. — 2011/10. — Т. 478, вып. 7370. — С. 506–510. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature10549.
31. ↑ Kentaro Yoshida Verena J Schuenemann Liliana M Cano Marina Pais Bagdevi Mishra Rahul Sharma Chirsta Lanz Frank N Martin Sophien Kamoun Johannes Krause Marco Thines Detlef Weigel Hernán A Burbano The rise and fall of the Phytophthora infestans lineage that triggered the Irish potato famine (англ.) // eLife. — 2013. — Май.

Литература

www-wikipediya.ru

Секвенирование древней ДНК — Википедия РУ

Секвенирование древней ДНК (aDNA, дДНК) — это секвенирование ДНК, извлечённой из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. Исследования нуклеотидных последовательностей, полученных путем секвенирования древней ДНК, позволяют устанавливать филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов[1].

При работе с древней ДНК исследователи сталкиваются со множеством проблем, связанных с сохранностью образцов. ДНК может деградировать с течением времени, химически модифицироваться. Такие методы как секвенирование нового поколения и обогащение ДНК-библиотек путем гибридизации позволяют заметно увеличить количество получаемых из образцов информации. В настоящее время возможно извлечение и анализ ДНК таких давно вымерших биологических видов, как, например, мамонты, неандертальцы или древние патогенные бактерии.

История

Исследования древней ДНК начались в 1984 году с секвенирования фрагмента митохондриальной ДНК квагги[2], подвида бурчелловой зебры, вымершего во второй половине XIX века. Было обнаружено, что ДНК не только сохраняется на протяжении более полутора века, но также может быть частично выделена и секвенирована. Вскоре после этого Сванте Паабо секвенировал образцы, полученные из человеческих мумий.[3][4] Эти исследования использовали бактериальное клонирование для амплификации фрагментов ДНК. Оказалось, что большая часть ДНК в образцах имеет бактериальное или грибное происхождение, а поддающаяся амплификации эндогенная ДНК состоит в основном из коротких повреждённых фрагментов многокопийных локусов (например, мтДНК) и составляет малую часть исследованной ДНК. Изобретение ПЦР позволило амплифицировать даже немногочисленные сохранившиеся фрагменты ДНК и дало толчок к развитию этой области, однако также увеличило чувствительность результатов к контаминации[5].

Области применения

Исследование древней ДНК имеет важное значение для таких областей науки как генетика, палеозоология, палеоэпидемология, антропология (особенно палеоантропология) и археология. От последней развилась отдельная отрасль науки — палеогенетика.

Анализ древней ДНК может использоваться для оценки эволюционной близости таксономических групп давно вымерших или сильно изменившихся организмов, конретные родственные связи которых выяснить иными способами крайне затруднительно. Особое внимание здесь уделяется областям высокой изменчивости — участкам ДНК, где мутации происходят часто. В частности, это короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Особенно перспективным является анализ митохондриальной ДНК, так как она имеет гораздо большее количество копий по сравнению с ядерной ДНК (около 1000 копий митохондриальных ДНК и 2 копии ядерной ДНК на клетку)[6].

Анализ древней ДНК также позволяет устанавливать половую принадлежность скелетных останков представителей видов, женские и мужские особи которых отличаются набором половых хромосом, что особенно важно, когда другие методы, например антропометрия, не могут дать точного ответа[7].

Значимый интерес вызывает дДНК и в контексте палеоэпидемологии. Диагностику заболеваний по скелетным останкам и изучение древних пандемий крайне сложно проводить без анализа ДНК возбудителей, сохранившейся в останках больных. Такие исследования стали возможны только в 1990 годах. В ближайшие годы основное внимание будет уделяться обнаружению возможных вымерших инфекционных бактериальных штаммов, а также сопоставлению детектируемых по останкам симптомов болезни с современными знаниями о конкретном заболевании. С увеличением количества данных изучение дДНК может внести важный вклад в историческую эпидемиологию в будущем[8].

Технические сложности

Деградация ДНК

Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли.[9] Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (англ.) (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР[9][5]. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 п.н., причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования дДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам[10].

При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет[9][5].

Примесь чужеродной ДНК

Часто вследствие загрязнения, или контаминации, лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК.[1]

Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации[1][5]. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов. Хорошим способом убедиться (и убедить научное сообщество) в истинности результатов является повторение исследования в другой лаборатории[5]. Многие археологические образцы, особенно найденные давно, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК[1]. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата[5].

В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминирования[11]. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК[12]. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации[5].

Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах

Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики[5].

Методы обработки древней ДНК

В качестве источника древней ДНК часто стараются использовать сохранившиеся части тела, не представляющие большого интереса с точки зрения анатомического строения. Из-за описанных выше процессов в большинстве древних образцов содержание интересующей исследователей древней ДНК очень мало — всего около 1 %. Это количество сильно варьирует в зависимости от природы образца. Последние исследования показывают, что значительно больший выход эндогенной ДНК из останков предков человека достигается при выделении материала из зубов и каменистой части височной кости.[13]

Первым шагом является измельчение образца и выделение ДНК. В случае костных остатков используют пескоструйные пистолеты или специализированные дрели для первичной фрагментации. Далее частицы ещё более измельчаются(до порошкообразного состояния) на перемешивающих мельницах. Порошок последовательно обрабатывается набором реагентов и подвергается центрифугированию для очистки ДНК от минералов и прочих примесей[14].

Следующий этап — изготовление ДНК-библиотек и их обогащение путем гибридизации[15]. Непосредственное получение нуклеотидной последовательности осуществляется путем секвенирования нового поколения.

В 2012 году в статье журнала Methods of Molecular Biology были представлены возможные методы выделения древней ДНК из сохранившихся растительных образцов. Как и в случае с древней ДНК животных, палеорастительные образцы доходят в сохранном виде до нашего времени зачастую из-за охлаждения во время масштабных оледенений[16].

«Допотопная» ДНК

«Допотопной» (англ. antediluvian) была названа ДНК старше 1 миллиона лет. Название было предложено в 1993 году Томасом Линдалом (Tomas Lindahl) в обзоре в Nature[17]. В 90-е годы появились сообщения о секвенировании ДНК, сохранившейся на протяжении миллионов лет в ископаемых остатках растений, костях динозавров и инклюзах в янтаре. Некоторые из этих результатов с большой вероятностью являются следствием контаминации, другие оказались невоспроизводимы.[9][5] Например, в ответ на публикацию в Science о секвенировании фрагмента митохондриальной ДНК из кости динозавра мелового периода (80 млн лет назад), вышли заметки, в одной из которых было указано, что при построении филогенетического дерева последовательность из кости динозавра кластеризуется с человеческой, а не с ортологичным участком из мтДНК птиц или крокодила, что свидетельствует о большой вероятности контаминации[18]; в другой заметке высказывалось предположение[19], что последовательность, приписанная динозавру, — это на самом деле древняя вставка мтДНК в человеческой хромосоме, попавшей в образец[20].

ДНК животных плейстоцена

Хорошо сохранившиеся образцы позволяют частично, а в некоторых случаях даже полностью секвенировать ядерный геном. В 2008 году была секвенирована ДНК, полученная из шерсти двух мамонтов, умерших около 20 и 59 тысяч лет назад. Картирование на черновую сборку генома африканского слона позволило оценить долю эндогенной ДНК в этих образцах в 90 % и 58 % соответственно; большую часть загрязнения в обоих случаях составили бактериальная ДНК и последовательности, происхождение которых определить не удалось. Полученные данные позволили оценить время расхождения между мамонтом и африканским слоном в 7,5 млн лет, а время расхождения между двумя линиями мамонта, для которых были взяты образцы, — в 1,5-2 млн лет. При этом секвенированная ДНК мамонтов совпадает со слоновьей на 99,41 % на нуклеотидном уровне и 99,78 % на аминокислотном уровне (то есть различие составляет примерно 1 остаток на белок). Принадлежность М4 и М25 к разным кладам была установлена ранее на основе секвенирования митохондриальной ДНК, и новая оценка на время расхождения согласуется с оценкой по мтДНК и уточняет последнюю. Одной из целей секвенирования мамонта было определение функционально важных аминокислотных различий между мамонтом и слоном. Были отобраны 92 различия между этими видами, которые могут иметь функциональное значение, и часть из которых, возможно, находилась под положительным отбором[21].

В одном из более ранних исследований в качестве образцов были взяты хорошо сохранившиеся при низких температурах останки восьми мамонтов из Музея мамонта в Хатанге. Для лучшего образца 45,4 % фрагментов ДНК выравнивались на сборку генома слона, при этом сходство между ДНК слона и мамонта составило 98,55 % без поправки на увеличение числа различий из-за дезаминации[22].

В 2013 году была получена черновая версия генома древней лошади[23]. Возраст образца оценивается в 560—780 тысяч лет. По состоянию на конец 2013 года это самый древний полный ядерный геном. Также были секвенированы ДНК лошади из позднего плейстоцена (~43 тысячи лет назад), пяти современных пород лошадей, лошади Пржевальского и осла. Филогенетический анализ показал, что последний общий предок всего рода Лошади жил 4-4,5 миллиона лет назад, что оказалось вдвое больше принятой до того оценки; популяции предков лошади Пржевальского и домашней лошади разошлись 38-72 тысячи лет назад. В том же году была восстановлена последовательность митохондриальной ДНК пещерного медведя из испанской Пещеры Костей, жившего в среднем плейстоцене, 179—680 тыс. лет назад, причём техника подготовки дДНК к секвенированию была оптимизирована для лучшего прочтения коротких (30-50 пн) фрагментов[10]. По состоянию на октябрь 2013-го, древний геном отсеквенирован с покрытием больше единицы только для таких позвоночных, как человек, белый медведь и лошадь.

ДНК древних людей

Неандертальцы

На данный момент в европейской части Евразии найдено множество останков неандертальцев. Первым шагом в изучении их генетического материала была работа с митохондриальной ДНК, выделенной из костей, которые были обнаружены в 1856 году в долине реки Неандерталь (Германия). В 2006 году был начат проект по секвенированию полного генома неандертальца. В работе использовалась ДНК останков из пещеры Виндия в Хорватии, а также из некоторых других костей. Выравнивание полученного генома вместе с геномом современного человека и геномом шимпанзе, позволило грубо оценить время расхождения современного человека и неандертальца в 270—440 тыс. лет в предположении, что человек и шимпанзе разошлись 6,5 млн лет назад[24]. Геномы неандертальцев из пещеры Сидрон (англ.) (Испания), пещеры Фельдхофер (англ.) (Германия), Мезмайской пещеры (Россия) незначительно отличаются от первого.

Секвенирование ДНК древних людей даёт надежду установить функциональные геномные мутации, которые отличают древнего человека от обезьяны, а также проследить отличия современного человека от древних людей. Исследование выявило удивительно малое количество зафиксировавшихся замен в геноме за довольно долгое время. Было найдено всего лишь 5 генов, в которых у современного человека зафиксировалось больше одной замены, меняющей структуру белка (по сравнению с неандертальцем, который в этих локусах совпал с шимпанзе): RPTN (англ.), SPAG17, CAN15, TTF1 (англ.) и PCD16.

Сравнение разнообразия SNP для неандертальцев и современного человека позволяет локализовать мишени положительного отбора в геноме. Самый обширный такой участок генома, выявленный анализом различий SNP, принадлежит гену THADA (англ.), и SNP в ближайшем его окружении ассоциированы с диабетом 2 типа, а экспрессия этого гена существенно различается для больных диабетом и здоровых людей. В этом же регионе была обнаружена вставка 9 нуклеотидов в геноме человека, которая отсутствует у всех известных геномов от мыши до приматов и у неандертальца. Также SNP в других регионах ассоциируются с шизофренией, синдромом Дауна, аутизмом. Интерес представляет ген RUNX2 (англ.), который является единственным известным на данный момент геном, связанным с развитием ключично-черепного дизостоза. Анализ SNP также выявляет примесь генетического материала неандертальцев в ДНК неафриканцев, что подтверждает теорию о скрещивании неандертальцев с современными людьми, произошедшем после выхода популяции последних из Африки.

Денисовцы

Именно анализ древней ДНК позволил обнаружить этот вид древних людей — изначально считалось, что найденные в Денисовой пещере фрагменты скелета (две фаланги пальцев и три коренных зуба) принадлежат неандертальцам. Секвенирование митохондриальной ДНК останков опровергло теорию и показало, что они принадлежат отдельной группе. Различие денисовцев и современных людей в 2 раза превышает различие неандертальцев и современных людей, однако для ядерной ДНК эти различия имеют одинаковый порядок. Возможное объяснение состоит в том, что денисовцы и неандертальцы происходят от общего предка, который ранее отделился от ветви будущего современного человека. Эту гипотезу подтвердило сравнение двух геномов древних людей (денисовец, неандерталец) и пяти геномов современных людей (представителей Франции, Китая, Папуа — Новой Гвинеи, африканских народностей Йоруба и Бушменов), а также выравнивание геномов денисовцев, неандертальцев и африканцев Йоруба на геном шимпанзе. Помимо этого, исследование показало, что денисовцы и неандертальцы являются сестринскими группами. Также было показано, что денисовцы, как и неандертальцы, скрещивались с некоторыми неафриканскими популяциями современных людей: примесь ДНК неандертальцев присутствует во всех неафриканских группах, а примесь денисовцев — у папуасов и меланезийцев.[12].

Филогенетические выводы по данным ядерной и митохондриальной ДНК расходятся. Это может объясняться, тем, что мтДНК денисовцев происходит из некой древней линии, которая не прижилась в неандертальцах и современных людях. Большой размер древних популяций делает эту гипотезу правдоподобной, хотя для однозначного разрешения этой проблемы данных пока недостаточно.

Гейдельбергский человек

Анализ практически полного митохондриального генома гейдельбергского человека из Пещеры Костей позволил оценить возраст находки в 150—640 тысяч лет и показал, что митохондриальные геномы более схожи для гейдельбергского человека и денисовцев, чем для указанных видов и неандертальца, хотя по морфологическим признакам люди из Пещеры Костей близки к неандертальцам. Есть несколько возможных объяснений. Люди из Пещеры Костей могут представлять группу, отличную и от неандертальцев, и от денисовцев, которая внесла вклад в денисовскую мтДНК, но эта версия не объясняет морфологических черт неандертальцев у вида, напрямую с ними не связанного. Второе возможное объяснение состоит в том, что гейдельбергские люди относятся к общим предкам неандертальцев и денисовцев, однако эта версия предполагает существование в этой группе двух сильно разошедшихся линий мтДНК, предковых для неандертальцев и денисовцев. В третьих, не исключено влияние малоисследованных подвидов человека, которые могли сделать вклад в мтДНК гейдельберских людей и денисовцев. Анализ ядерной ДНК может прояснить картину[25].

Древняя эпигенетика

Информация о метилировании цитозинов в CpG (англ.) может быть восстановлена непосредственно по данным секвенирования[26]. При дезаминировании, которое происходит случайно с течением времени, неметилированный цитозин превращается в урацил, а метилированный — в тимин. Протокол секвенирования древней ДНК предполагает обработку ДНК урацил-ДНК-гликозилазой и эндонуклеазой VIII, в результате которой урацил удаляется и молекула ДНК раскусывается в соответствующем месте с удалением поврежденного нуклеотида[27]. В результате при секвенировании для тех позиций, где цитозин был метилирован, будет получен большой процент чтений с Т, а неметилированный цитозин прочитается как C по тем молекулам, где дезаминирование в этом месте не произошло.

По последовательности ДНК, извлечённой из волос 4000-летних останков палеоэскимоса удалось построить полногеномную карту расположения нуклеосом и метилирования[28], причём профиль метилирования оказался близок к тому, что наблюдается в волосах современного человека.

Также восстановлена карта метилирования для неандертальцев и денисовцев[26][29]. Их метилом оказался похож на метилом современного человека, особенно в районе генов «домашнего хозяйства», однако найдено около 2000 областей со значимыми отличиями в метилировании. В частности, у древних людей найдены заметилированные участки в кластере HOXD, задействованном в регуляции развития конечностей, что может объяснять такие анатомические различия между ними и современными людьми, как менее длинные конечности, крупные кисти, широкие локтевые и коленные суставы[26][29].

Патогены

Современные методы экстракции и секвенирования древней ДНК позволяют проводить исследования патогенов, полученных из останков давно умерших от болезни людей. Филогенетический анализ полученных образцов позволяет восстанавливать эволюцию болезнетворных организмов. Секвенированы средневековые штаммы чумной палочки и палочки Хансена, а также штамм палочки Коха XIX-го века.

Чумная палочка

Исследования дДНК чумной палочки (Yersinia pestis), полученных из лондонских захоронений жертв «Чёрной смерти» установили, что чумная палочка того времени, если не считать возможных геномных перестроек, характерных для этого вида, и ограничиться однонуклеотидными полиморфизмами, мало отличалась от современных штаммов. Более того, для всех полиморфизмов, отличающих её от современного штамма, в ней присутствовал вариант предка чумной палочки — Y. pseudotuberculosis. Эти данные позволяют предполагать, что генотип древней чумной палочки не являлся главной причиной её высокой вирулентности в то время и, возможно, его вклад был наравне с вкладом таких факторов, как генетически обусловленная восприимчивость носителей, климат, социальные условия, взаимодействия с другими болезнями. При помощи филогенетического анализа был установлен временной интервал, в который жил последний общий предок всех современных патогенных для человека штаммов чумной палочки: 1282—1343 года, причём древняя бактерия оказалась ближе всего к предковому узлу филогенетического дерева[30].

Фитофтора

В 2013 году было опубликовано показательное исследование в области секвенирования старых патогенов, посвященное не существующим ныне штаммам фитофторы (Phytophthora infestans), которые вызвали Великий Картофельный Голод в Ирландии в середине XIX века. Генетический материал этих патогенов был выделен из сохраненных листьев картофеля и томата разного времени. До настоящего времени, ввиду отсутствия методов секвенирования, анализ данных был невозможен. Ученые провели анализ разных штаммов патогенов, выделив родственные штаммы из растений в Ирландии, Северной Америки и Европы. Исследования показали, что группа штаммов вызвавшая вышеупомянутый голод (HERB-1) и Северо-Американская группа (US-1) имели последнего общего предка предположительно на территории Мексики на рубеже XVIII и XIX веков.

Это исследование особенно интересно с точки зрения подходов к анализу дДНК возбудителей прошедших эпидемий как животных, так и растений. Данная область находится на раннем этапе своего развития, однако в случае систематического создания биологических банков, подобные знания могут значительно способствовать ускоренному поиску противомикробных препаратов в ближайшем будущем, в случае возникновения эпидемий, вызванных родственными возбудителями[31].

См. также

Примечания

1. ↑ 1 2 3 4 B. Shapiro, M. Hofreiter (24 January 2014). «A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA». Science 343 no. 6169: 3—16. DOI:10.1126/science.1236573.
2. ↑ Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 312, no. 5991. — P. 282—284. — DOI:10.1038/312282a0. — PMID 6504142.
3. ↑ Pääbo S. Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 314, no. 6062. — P. 644—645. — DOI:10.1038/314644a0. — PMID 3990798.
4. ↑ Pääbo S. Molecular genetic investigations of ancient human remains (англ.) // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. — 1986. — Vol. 51, no. Pt 1. — P. 441—446. — PMID 3107879.
5. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Eske Willerslev and Alan Cooper (January 2005). «Review Paper. Ancient DNA». Proc. R. Soc. B 272 no. 1558: 3—16. DOI:10.1098/rspb.2004.2813.
6. ↑ Ermanno Rizzi, Martina Lari, Elena Gigli, Gianluca De Bellis, David Caramelli Ancient DNA studies: new perspectives on old samples (En) // Genetics Selection Evolution. — 2012/12. — Т. 44, вып. 1. — С. 21. — ISSN 1297-9686. — DOI:10.1186/1297-9686-44-21.
7. ↑ Pontus Skoglund, Jan Storå, Anders Götherström, Mattias Jakobsson Accurate sex identification of ancient human remains using DNA shotgun sequencing // Journal of Archaeological Science. — Т. 40, вып. 12. — С. 4477–4482. — DOI:10.1016/j.jas.2013.07.004.
8. ↑ Adrian M. Whatmore Ancient-Pathogen Genomics: Coming of Age? (англ.) // mBio. — 2014-10-31. — Vol. 5, iss. 5. — P. e01676–14. — ISSN 2150-7511. — DOI:10.1128/mbio.01676-14.
9. ↑ 1 2 3 4 Michael Hofreiter, David Serre, Hendrik N. Poinar, Melanie Kuch and Svante Pääbo (2001). «Ancient DNA». Nature Reviews Genetics 2: 353—359. DOI:10.1038/35072071.
10. ↑ 1 2 Jesse Dabney et al. (9 September 2013). «Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments». PNAS. DOI:10.1073/pnas.1314445110.
11. ↑ Pontus Skoglund, Bernd H. Northoff, Michael V. Shunkov, Anatoli P. Derevianko, Svante Pääbo, Johannes Krause, and Mattias Jakobsson. (11 February 2014). «Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal». Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 111 no. 6: 2229—2234. DOI:10.1073/pnas.1318934111. Этот метод требует наличия референсного генома. В первом приближении метод выглядит следующим образом. Чтения выравниваются на геном, после чего рассматриваются позиции, где встречаются, например, цитозин и тимин. Сравниваются две модели: одна предполагает, что замена цитозина на тимин произошла в результате посмертной деградации ДНК, вторая предполагает, что это полиморфизм или ошибка секвенирования. Модель выбирается по методу максимального правдоподобия.
12. ↑ 1 2 David Reich et al. (23/30 December 2010). «Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia». Nature vol. 468: 1053—1060. DOI:10.1038/nature09710.
13. ↑ Henrik B. Hansen, Peter B. Damgaard, Ashot Margaryan, Jesper Stenderup, Niels Lynnerup Comparing Ancient DNA Preservation in Petrous Bone and Tooth Cementum (англ.) // PLOS ONE. — 2017-01-27. — Vol. 12, iss. 1. — P. e0170940. — ISSN 1932-6203. — DOI:10.1371/journal.pone.0170940.
14. ↑ Jesse Dabney, Michael Knapp, Isabelle Glocke, Marie-Theres Gansauge, Antje Weihmann Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013-09-24. — Vol. 110, iss. 39. — P. 15758–15763. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — DOI:10.1073/pnas.1314445110.
15. ↑ Iosif Lazaridis, Dani Nadel, Gary Rollefson, Deborah C. Merrett, Nadin Rohland Genomic insights into the origin of farming in the ancient Near East (En) // Nature. — 2016/08. — Т. 536, вып. 7617. — С. 419–424. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature19310.
16. ↑ Beth Shapiro and Michael Hofreiter (eds.). Ancient DNA: Methods and Protocols. — Methods in Molecular Biology. — © Springer Science+Business Media, LLC 2012. — С. vol. 840. — ISBN DOI 10.1007/978-1-61779-516-9_10.
17. ↑ Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA (англ.) // Nature. — 1993. — Vol. 362, no. 6422. — P. 709—715. — DOI:10.1038/362709a0. — PMID 8469282.
18. ↑ S. Blair Hedges, Mary H. Schweitzer (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1191—1192. DOI:10.1126/science.7761839.
19. ↑ В то время сборки человеческого генома ещё не существовало. См. Проект «Геном человека»
20. ↑ Zischler H., Höss M., Handt O., von Haeseler A., van der Kuyl A.C., Goudsmit J. (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1193—4. DOI:10.1126/science.7605504.
21. ↑ Web Miller et al. (20 november 2008). «Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth». Nature vol. 456: 387—392. DOI:10.1038/nature07446.
22. ↑ Hendrik N. Poinar et al. (20 January 2006). «Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA». Science vol. 311: 392—394. DOI:10.1126/science.1123360.
23. ↑ Ludovic Orlando et al. (26 June 2013). «Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse». Nature vol. 499: 74—78. DOI:10.1038/nature12323.
24. ↑ Richard E. Green et al. (7 May 2010). «A Draft Sequence of the Neandertal Genome». Science vol. 328: 710—722. DOI:10.1126/science.1188021.
25. ↑ Matthias Meyer et al. (16 January 2014). «A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos». Nature 505: 403—406. DOI:10.1038/nature12788.
26. ↑ 1 2 3 Elizabeth Pennisi (18 April 2014). «Ancient DNA Holds Clues to Gene Activity in Extinct Humans». Science Vol. 344 no. 6181: pp. 245-246. DOI:10.1126/science.344.6181.245.
27. ↑ Briggs et al. (22 Dec 2009). «Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA». Nucl. Acids Res. Vol. 38 (6): pp. e87. DOI:10.1093/nar/gkp1163.
28. ↑ Jakob Skou Pedersen et al. (3 December 2013). «Genome-wide nucleosome map and cytosine methylation levels of an ancient human genome». Genome Res 24: 454—466. DOI:10.1101/gr.163592.113.
29. ↑ 1 2 David Gokhman, Eitan Lavi, Kay Prüfer, Mario F. Fraga, José A. Riancho, Janet Kelso, Svante Pääbo, Eran Meshorer, Liran Carmel (April 17 2014). «Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan». Science Published Online. DOI:10.1126/science.1250368.
30. ↑ Kirsten I. Bos, Verena J. Schuenemann, G. Brian Golding, Hernán A. Burbano, Nicholas Waglechner A draft genome of Yersinia pestis from victims of the Black Death (En) // Nature. — 2011/10. — Т. 478, вып. 7370. — С. 506–510. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature10549.
31. ↑ Kentaro Yoshida Verena J Schuenemann Liliana M Cano Marina Pais Bagdevi Mishra Rahul Sharma Chirsta Lanz Frank N Martin Sophien Kamoun Johannes Krause Marco Thines Detlef Weigel Hernán A Burbano The rise and fall of the Phytophthora infestans lineage that triggered the Irish potato famine (англ.) // eLife. — 2013. — Май.

Литература

http-wikipediya.ru

Миф о древних ДНК-генеалогических линиях африканцев (часть 1)

В академической литературе за последние четверть века регулярно появляются утверждения о том, что африканские ДНК-линии «самые древние», хотя основания для того не приводятся. И понятно, почему не приводятся – их просто нет. Давайте для начала разберемся, что такое «древние ДНК-линии», понимая под этим цепочки снипов Y-хромосомы.  Но разбираться особенно и не надо, потому что у всех мужчин на Земле, африканцев и неафриканцев, во всяком случае, у всех, кто делал тест на ДНК, снип-цепочки Y-хромосомы по древности одинаковы. У всех эти цепочки снипов тянутся от общих предков с шимпанзе, орангутангом, гориллой, макакой и другими древними общими с нами предками. Ниже – характерный пример, процитированный еще в 2012 году в журнале Advances in Anthropology (Klyosov, Rozhanskii, Ryabchenko): 

Читайте другие статьи на Переформате:

pereformat.ru

Секвенирование древней ДНК Википедия

Секвенирование древней ДНК — определение нуклеотидной последовательности (секвенирование, от лат. sequentum — последовательность) применительно к молекулам ДНК, извлечённым из древних биологических образцов, таких как палеонтологические и археологические находки, мумифицированные останки, засохшие остатки растений, копролиты. Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных секвенированем древней ДНК, позволяют установить филогенетические отношения между видами и проверять гипотезы о связи изменений в окружающей среде и эволюционных изменений популяций, а также предоставляют информацию для калибровки молекулярных часов[1].

При работе с древней ДНК исследователи сталкиваются со множеством проблем, связанных с сохранностью образцов. ДНК может деградировать с течением времени, химически модифицироваться. Микроорганизмы, участвующие в разложении останков, не только нарушают целостность тканей, но и вносят в образец собственную ДНК, тем самым усложняя процесс выделения древней ДНК и биоинформатического анализа полученных данных. Такие методы, как секвенирование нового поколения и обогащение ДНК-библиотек путём гибридизации позволяют заметно увеличить количество получаемых из образцов информации.

Проведен анализ ДНК ряда древних животных, в том числе мамонта и пещерного медведя. Анализ ДНК из человеческих останков позволил выделить новую группу древних людей — денисовцев, а также выявить детали происхождения современных этнических групп. Ряд открытий был сделан в результате анализа древней ДНК болезнетворных микроорганизмов: произведен анализ генома чумной палочки из лондонских захоронений XIV века и гриба фитофторы из образцов XIX века.

История

Исследования древней ДНК начались в 1984 году с секвенирования фрагмента митохондриальной ДНК (мтДНК) вымершей во второй половине XIX квагги[2], подвида бурчелловой зебры. Было обнаружено, что ДНК не только сохраняется на протяжении более полутора веков, но также может быть частично выделена и секвенирована. Вскоре после этого Сванте Паабо секвенировал образцы, полученные из человеческих мумий.[3][4] В этих исследованиях ученый использовал бактериальное клонирование для амплификации фрагментов ДНК. Оказалось, что большая часть ДНК в образцах имеет бактериальное или грибное происхождение, а поддающаяся амплификации эндогенная ДНК состоит в основном из коротких повреждённых фрагментов многокопийных локусов (например, мтДНК) и составляет малую часть исследованной ДНК. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило амплифицировать даже немногочисленные сохранившиеся фрагменты ДНК и дало толчок к развитию этой области, однако также увеличило чувствительность результатов к контаминации[5].

Области применения

Исследование древней ДНК имеет важное значение для таких областей науки как генетика, палеозоология, палеоэпидемология, антропология (особенно палеоантропология) и археология. Также эта область стала частью методологии палеогенетики.

Анализ древней ДНК может использоваться для оценки эволюционной близости таксономических групп давно вымерших или сильно изменившихся организмов, конретные родственные связи которых выяснить иными способами крайне затруднительно. Особое внимание здесь уделяется областям высокой изменчивости — участкам ДНК, где мутации происходят часто. В частности, это короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Анализ митохондриальной ДНК дает более точную информацию в контексте этого метода, так как митохондриальная ДНК имеет гораздо большее количество копий по сравнению с ядерной ДНК (около 1000 копий митохондриальных ДНК и 2 копии ядерной ДНК на клетку)[6].

Анализ древней ДНК также позволяет устанавливать половую принадлежность скелетных останков представителей видов, женские и мужские особи которых отличаются набором половых хромосом, что особенно важно, когда другие методы, например антропометрия, не могут дать точного ответа[7].

Данный метод находит свое применение и в контексте палеоэпидемологии. Диагностику заболеваний по скелетным останкам и изучение древних пандемий крайне сложно проводить без анализа ДНК возбудителей, сохранившейся в останках больных. Такие исследования стали возможны только в 1990 годах, что позволило прослеживать как эволюцию инфекционных бактериальных штаммов и вирусов, так и их распространение, а также сопоставлять детектируемые по останкам симптомы болезни с современными знаниями о конкретном заболевании[8][9].

Технические сложности

Деградация ДНК

Обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли.[10] Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (англ.) (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование. Чаще происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. Эти повреждения происходят и в живых клетках, однако там они устраняются в процессе репарации. Кроме того, возникают поперечные сшивки между цепями спирали ДНК из-за алкилирования или сшивки ДНК с различными молекулами в результате реакции Майяра. Как и разрывы цепи, поперечные сшивки мешают амплификации при ПЦР[10][5]. Перед секвенированием древнюю ДНК подвергают специальной обработке, чтобы удалить продукты дезаминирования и поперечные сшивки. Средняя длина амплифицируемых фрагментов древней ДНК часто не превосходит 100 пар нуклеотидов, причём для находок из одного места раскопок средняя длина фрагментов убывает с увеличением возраста находки. Современные протоколы секвенирования древней ДНК учитывают эту особенность; в частности, вместо отжига праймеров на фрагменты ДНК к концам фрагментов присоединяются адаптеры, а праймерами служат олигонуклеотиды, комплементарные адаптерам[11].

При низких температурах деградация ДНК идет медленнее, что обеспечивает хорошую сохранность ДНК в образцах, найденных в районе вечной мерзлоты. Однако считается, что даже в идеальных условиях ДНК не может сохраняться на протяжении более 1 млн лет[10][5].

Примесь чужеродной ДНК

Часто вследствие загрязнения, или контаминации, лишь малая доля ДНК в образце имеет эндогенное происхождение. Лучшие в этом отношении образцы содержат до 90 % эндогенной ДНК.[1]

Археологические образцы всегда содержат некоторое количество ДНК бактерий и грибов, которые колонизируют останки, пока те лежат в земле. Кроме того, в процессе исследования древней ДНК в образец может попасть человеческая или микробная ДНК, присутствующая в любой лаборатории. В отличие от древней ДНК современная хорошо амплифицируется при ПЦР. Продукты ПЦР, содержащие амплифицированную современную ДНК, могут распространиться по лаборатории и увеличить таким образом степень контаминации[1][5]. Для профилактики лабораторной контаминации рекомендуется продолжительная обработка оборудования ультрафиолетом или кислотой и соблюдение требований протокола работы в ПЦР-лабораториях. Исследование древней ДНК не должно проводиться в лаборатории, где ранее изучались современные образцы, особенно близких видов[5]. Многие археологические образцы, особенно найденные до появления современных молекулярно-биологических методов, подверглись контаминации в процессе извлечения и исследования. Если образец был найден несколько десятилетий назад, человеческая ДНК, которой он загрязнен, может обладать всеми признаками древней ДНК. Кости и зубы имеют пористую поверхность, что делает проблематичной их очистку от современной ДНК. Волосы оказываются в этом отношении предпочтительнее: содержащаяся в них ДНК малодоступна для бактерий, а гидрофобная поверхность позволяет очистить их перед извлечением ДНК[1]. В этом случае совпадение последовательностей, полученных в результате независимого исследования разных частей образца (например, бедра и зубов) в разных лабораториях свидетельствует в пользу истинности результата[5].

В случае человеческих останков контаминация современной человеческой ДНК может приводить к ошибкам при исследовании филогении и популяционной генетики. Существует статистический метод, позволяющий отличать древнюю ДНК от современной по паттерну дезаминирования[12][13]. Если известно, что образец ДНК принадлежит женщине, можно картировать отсеквенированные последовательности на Y-хромосому и детектировать таким образом попадание в образец мужской ДНК[14]. Если исследуется ДНК нечеловеческого происхождения, очевидным способом проверки на контаминацию является картирование полученных при секвенировании чтений на человеческий геном, а также на геномы других организмов в случае, если они могли быть источниками контаминации. При секвенировании древней бактериальной ДНК проблема состоит также в том, что известны геномы далеко не всех существующих ныне бактерий, так что из того, что полученная последовательность не входит в известные бактериальные геномы, нельзя заключить, что она принадлежит древней бактерии, а не получена в результате контаминации[5].

Вставки мтДНК и хпДНК в хромосомах

Вставки митохондриальной и пластидной ДНК часто встречаются в ядерной ДНК. При исследовании древних образцов ДНК нельзя выделить ДНК органелл, поэтому эти вставки могут быть источником ошибок, так как их не всегда легко отличить по последовательности от настоящей мтДНК или хпДНК. Если такие вставки будут приняты за ДНК органелл, это может исказить результаты исследования филогении или популяционной генетики[5].

Методы обработки древней ДНК

В качестве источника древней ДНК часто стараются использовать сохранившиеся части тела, не представляющие большого интереса с точки зрения анатомического строения. Из-за описанных выше процессов в большинстве древних образцов содержание интересующей исследователей древней ДНК очень мало — всего около 1 %. Это количество сильно варьирует в зависимости от природы образца. Последние исследования показывают, что значительно больший выход эндогенной ДНК из останков предков человека достигается при выделении материала из зубов и каменистой части височной кости.[15]

Первым шагом является измельчение образца и выделение ДНК. В случае костных остатков используют пескоструйные пистолеты или специализированные дрели для первичной фрагментации. Далее частицы ещё более измельчаются (до порошкообразного состояния) на перемешивающих мельницах. Порошок последовательно обрабатывается набором реагентов и подвергается центрифугированию для очистки ДНК от минералов и прочих примесей[16].

Следующий этап — изготовление ДНК-библиотек и их обогащение путем гибридизации[17]. Непосредственное получение нуклеотидной последовательности осуществляется путем секвенирования нового поколения.

В 2012 году в статье журнала Methods of Molecular Biology были представлены возможные методы выделения древней ДНК из сохранившихся растительных образцов. Как и в случае с древней ДНК животных, палеорастительные образцы доходят в сохранном виде до нашего времени зачастую из-за охлаждения во время масштабных оледенений[18].

«Допотопная» ДНК

«Допотопной» (англ. antediluvian) была названа ДНК старше 1 миллиона лет. Название было предложено в 1993 году Томасом Линдалом (Tomas Lindahl) в обзоре в Nature[19]. В 1990-е годы появились сообщения о секвенировании ДНК, сохранившейся на протяжении миллионов лет в ископаемых остатках растений, костях динозавров и инклюзах в янтаре. Некоторые из этих результатов с большой вероятностью являются следствием контаминации, другие оказались невоспроизводимы.[10][5] Например, в ответ на публикацию в Science о секвенировании фрагмента митохондриальной ДНК из кости динозавра мелового периода (80 млн лет назад), вышли заметки, в одной из которых было указано, что при построении филогенетического дерева последовательность из кости динозавра кластеризуется с человеческой, а не с ортологичным участком из мтДНК птиц или крокодила, что свидетельствует о большой вероятности контаминации[20]; в другой заметке высказывалось предположение[21], что последовательность, приписанная динозавру, — это на самом деле древняя вставка мтДНК в человеческой хромосоме, попавшей в образец[22].

ДНК животных плейстоцена

Хорошо сохранившиеся образцы позволяют частично, а в некоторых случаях даже полностью секвенировать ядерный геном. В 2008 году была секвенирована ДНК, полученная из шерсти двух мамонтов, умерших около 20 и 59 тысяч лет назад. Картирование на черновую сборку генома африканского слона позволило оценить долю эндогенной ДНК в этих образцах в 90 % и 58 % соответственно; большую часть загрязнения в обоих случаях составили бактериальная ДНК и последовательности, происхождение которых определить не удалось. Полученные данные позволили оценить время расхождения между мамонтом и африканским слоном в 7,5 млн лет, а время расхождения между двумя линиями мамонта, для которых были взяты образцы, — в 1,5-2 млн лет. При этом секвенированная ДНК мамонтов совпадает со слоновьей на 99,41 % на нуклеотидном уровне и 99,78 % на аминокислотном уровне (то есть различие составляет примерно 1 остаток на белок). Принадлежность М4 и М25 к разным кладам была установлена ранее на основе секвенирования митохондриальной ДНК, и новая оценка на время расхождения согласуется с оценкой по мтДНК и уточняет последнюю. Одной из целей секвенирования мамонта было определение функционально важных аминокислотных различий между мамонтом и слоном. Были отобраны 92 различия между этими видами, которые могут иметь функциональное значение, и часть из которых, возможно, находилась под положительным отбором[23].

В одном из более ранних исследований в качестве образцов были взяты хорошо сохранившиеся при низких температурах останки восьми мамонтов из Музея мамонта в Хатанге. Для лучшего из отобранных образцов 45,4 % фрагментов ДНК выравнивались на сборку генома слона, при этом сходство между ДНК слона и мамонта составило 98,55 % без поправки на увеличение числа различий из-за дезаминации[24].

В 2013 году была получена черновая версия генома древней лошади[25]. Возраст образца оценивается в 560—780 тысяч лет. По состоянию на конец 2013 года это самый древний полный ядерный геном. Также были секвенированы ДНК лошади из позднего плейстоцена (~43 тысячи лет назад), пяти современных пород лошадей, лошади Пржевальского и осла. Филогенетический анализ показал, что последний общий предок всего рода Лошади жил 4-4,5 миллиона лет назад, что оказалось вдвое больше принятой до того оценки; популяции предков лошади Пржевальского и домашней лошади разошлись 38-72 тысячи лет назад. В том же году была восстановлена последовательность митохондриальной ДНК пещерного медведя из испанской Пещеры Костей, жившего в среднем плейстоцене, 179—680 тыс. лет назад, причём техника подготовки древней ДНК к секвенированию была оптимизирована для лучшего прочтения коротких (30-50 пн) фрагментов[11]. По состоянию на октябрь 2013-го, древний геном отсеквенирован с покрытием больше единицы только для таких позвоночных, как человек, белый медведь и лошадь.

ДНК древних людей

Неандертальцы

Первым шагом в изучении генетического материала неандертальцев была работа с митохондриальной ДНК, выделенной из костей, которые были обнаружены в 1856 году в долине реки Неандерталь (Германия). В 2006 году был начат проект по секвенированию полного генома неандертальца. В работе использовалась ДНК останков из пещеры Виндия в Хорватии, а также из некоторых других костей. Выравнивание полученного генома вместе с геномом современного человека и геномом шимпанзе, позволило грубо оценить время расхождения современного человека и неандертальца в 270—440 тыс. лет в предположении, что человек и шимпанзе разошлись 6,5 млн лет назад[26]. Геномы неандертальцев из пещеры Сидрон (англ.) (Испания), пещеры Фельдхофер (англ.) (Германия), Мезмайской пещеры (Россия) незначительно отличаются от первого.

Секвенирование ДНК древних людей даёт надежду установить функциональные геномные мутации, которые отличают древнего человека от обезьяны, а также проследить отличия современного человека от древних людей. Исследование выявило удивительно малое количество зафиксировавшихся замен в геноме за довольно долгое время. Было найдено всего лишь 5 генов, в которых у современного человека зафиксировалось больше одной замены, меняющей структуру белка (по сравнению с неандертальцем, который в этих локусах совпал с шимпанзе): RPTN (англ.), SPAG17, CAN15, TTF1 (англ.) и PCD16.

Сравнение разнообразия SNP для неандертальцев и современного человека позволяет локализовать мишени положительного отбора в геноме. Самый обширный такой участок генома, выявленный анализом различий SNP, принадлежит гену THADA (англ.), и SNP в ближайшем его окружении ассоциированы с диабетом 2 типа, а экспрессия этого гена существенно различается для больных диабетом и здоровых людей. В этом же регионе была обнаружена вставка 9 нуклеотидов в геноме человека, которая отсутствует у всех известных геномов от мыши до приматов и у неандертальца. Также SNP в других регионах ассоциируются с шизофренией, синдромом Дауна, аутизмом. Интерес представляет ген RUNX2 (англ.), который является единственным известным на данный момент геном, связанным с развитием ключично-черепного дизостоза. Анализ SNP также выявляет примесь генетического материала неандертальцев в ДНК неафриканцев, что подтверждает теорию о скрещивании неандертальцев с современными людьми, произошедшем после выхода популяции последних из Африки.

Денисовцы

Именно анализ древней ДНК позволил обнаружить этот вид древних людей — изначально считалось, что найденные в Денисовой пещере фрагменты скелета (две фаланги пальцев и три коренных зуба) принадлежат неандертальцам. Секвенирование митохондриальной ДНК останков опровергло теорию и показало, что они принадлежат отдельной группе. Различие денисовцев и современных людей в 2 раза превышает различие неандертальцев и современных людей, однако для ядерной ДНК эти различия имеют одинаковый порядок. Возможное объяснение состоит в том, что денисовцы и неандертальцы происходят от общего предка, который ранее отделился от ветви будущего современного человека. Эту гипотезу подтвердило сравнение двух геномов древних людей (денисовец, неандерталец) и пяти геномов современных людей (представителей Франции, Китая, Папуа — Новой Гвинеи, африканских народностей йоруба и бушменов), а также выравнивание геномов денисовцев, неандертальцев и африканцев йоруба на геном шимпанзе. Помимо этого, исследование показало, что денисовцы и неандертальцы являются сестринскими группами. Также было показано, что денисовцы, как и неандертальцы, скрещивались с некоторыми неафриканскими популяциями современных людей: примесь ДНК неандертальцев присутствует во всех неафриканских группах, а примесь денисовцев — у папуасов и меланезийцев[14].

Филогенетические выводы по данным ядерной и митохондриальной ДНК расходятся. Это может объясняться, тем, что мтДНК денисовцев происходит из некой древней линии, которая не прижилась в неандертальцах и современных людях. Большой размер древних популяций делает эту гипотезу правдоподобной, хотя для однозначного разрешения этой проблемы данных пока недостаточно.

Гейдельбергский человек

Анализ практически полного митохондриального генома гейдельбергского человека из Пещеры Костей позволил оценить возраст находки в 150—640 тысяч лет и показал, что митохондриальные геномы более схожи для гейдельбергского человека и денисовцев, чем для указанных видов и неандертальца, хотя по морфологическим признакам люди из Пещеры Костей близки к неандертальцам. Есть несколько возможных объяснений. Люди из Пещеры Костей могут представлять группу, отличную и от неандертальцев, и от денисовцев, которая внесла вклад в денисовскую мтДНК, но эта версия не объясняет морфологических черт неандертальцев у вида, напрямую с ними не связанного. Второе возможное объяснение состоит в том, что гейдельбергские люди относятся к общим предкам неандертальцев и денисовцев, однако эта версия предполагает существование в этой группе двух сильно разошедшихся линий мтДНК, предковых для неандертальцев и денисовцев. В третьих, не исключено влияние малоисследованных подвидов человека, которые могли сделать вклад в мтДНК гейдельберских людей и денисовцев. Анализ ядерной ДНК может прояснить картину[27].

Древняя эпигенетика

Информация о метилировании цитозинов в CpG (англ.) может быть восстановлена непосредственно по данным секвенирования[28]. При дезаминировании, которое происходит случайно с течением времени, неметилированный цитозин превращается в урацил, а метилированный — в тимин. Протокол секвенирования древней ДНК предполагает обработку ДНК урацил-ДНК-гликозилазой и эндонуклеазой VIII, в результате которой урацил удаляется и молекула ДНК раскусывается в соответствующем месте с удалением поврежденного нуклеотида[29]. В результате при секвенировании для тех позиций, где цитозин был метилирован, будет получен большой процент чтений с Т, а неметилированный цитозин прочитается как C по тем молекулам, где дезаминирование в этом месте не произошло.

По последовательности ДНК, извлечённой из волос 4000-летних останков палеоэскимоса удалось построить полногеномную карту расположения нуклеосом и метилирования[30], причём профиль метилирования оказался близок к тому, что наблюдается в волосах современного человека.

Также восстановлена карта метилирования для неандертальцев и денисовцев[28][31]. Их метилом оказался похож на метилом современного человека, особенно в районе генов «домашнего хозяйства», однако найдено около 2000 областей со значимыми отличиями в метилировании. В частности, у древних людей найдены заметилированные участки в кластере HOXD, задействованном в регуляции развития конечностей, что может объяснять такие анатомические различия между ними и современными людьми, как менее длинные конечности, крупные кисти, широкие локтевые и коленные суставы[28][31].

Патогены

Современные методы экстракции и секвенирования древней ДНК позволяют проводить исследования патогенов, полученных из останков давно умерших от болезни людей. Филогенетический анализ полученных образцов позволяет восстанавливать эволюцию болезнетворных организмов. Секвенированы средневековые штаммы чумной палочки и палочки Хансена, а также штамм палочки Коха XIX-го века.

Чумная палочка

Исследования древней ДНК чумной палочки (Yersinia pestis), полученных из лондонских захоронений жертв «Чёрной смерти» установили, что чумная палочка того времени, если не считать возможных геномных перестроек, характерных для этого вида, и ограничиться однонуклеотидными полиморфизмами, мало отличалась от современных штаммов. Более того, для всех полиморфизмов, отличающих её от современного штамма, в ней присутствовал вариант предка чумной палочки — Y. pseudotuberculosis. Эти данные позволяют предполагать, что генотип древней чумной палочки не являлся главной причиной её высокой вирулентности в то время и, возможно, его вклад был наравне с вкладом таких факторов, как генетически обусловленная восприимчивость носителей, климат, социальные условия, взаимодействия с другими болезнями. При помощи филогенетического анализа был установлен временной интервал, в который жил последний общий предок всех современных патогенных для человека штаммов чумной палочки: 1282—1343 года, причём древняя бактерия оказалась ближе всего к предковому узлу филогенетического дерева[32].

Фитофтора

В 2013 году было опубликовано показательное исследование в области секвенирования старых патогенов, посвященное не существующим ныне штаммам фитофторы (Phytophthora infestans), которые вызвали Ирландский картофельный голод в середине XIX века. Генетический материал этих патогенов был выделен из сохраненных листьев картофеля и томата разного времени. До настоящего времени, ввиду отсутствия методов секвенирования, анализ данных был невозможен. Ученые провели анализ разных штаммов патогенов, выделив родственные штаммы из растений в Ирландии, Северной Америки и Европы. Исследования показали, что группа штаммов вызвавшая вышеупомянутый голод (HERB-1) и Северо-Американская группа (US-1) имели последнего общего предка предположительно на территории Мексики на рубеже XVIII и XIX веков.

Это исследование особенно интересно с точки зрения подходов к анализу древней ДНК возбудителей прошедших эпидемий как животных, так и растений. Данная область находится на раннем этапе своего развития, однако в случае систематического создания биологических банков, подобные знания могут значительно способствовать ускоренному поиску противомикробных препаратов в ближайшем будущем, в случае возникновения эпидемий, вызванных родственными возбудителями[33].

См. также

Примечания

1. ↑ 1 2 3 4 B. Shapiro, M. Hofreiter (24 January 2014). «A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA». Science 343 no. 6169: 3—16. DOI:10.1126/science.1236573.
2. ↑ Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 312, no. 5991. — P. 282—284. — DOI:10.1038/312282a0. — PMID 6504142.
3. ↑ Pääbo S. Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA (англ.) // Nature. — 1985. — Vol. 314, no. 6062. — P. 644—645. — DOI:10.1038/314644a0. — PMID 3990798.
4. ↑ Pääbo S. Molecular genetic investigations of ancient human remains (англ.) // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. — 1986. — Vol. 51, no. Pt 1. — P. 441—446. — PMID 3107879.
5. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Eske Willerslev and Alan Cooper (January 2005). «Review Paper. Ancient DNA». Proc. R. Soc. B 272 no. 1558: 3—16. DOI:10.1098/rspb.2004.2813.
6. ↑ Ermanno Rizzi, Martina Lari, Elena Gigli, Gianluca De Bellis, David Caramelli Ancient DNA studies: new perspectives on old samples (En) // Genetics Selection Evolution. — 2012/12. — Т. 44, вып. 1. — С. 21. — ISSN 1297-9686. — DOI:10.1186/1297-9686-44-21.
7. ↑ Pontus Skoglund, Jan Storå, Anders Götherström, Mattias Jakobsson Accurate sex identification of ancient human remains using DNA shotgun sequencing // Journal of Archaeological Science. — Т. 40, вып. 12. — С. 4477–4482. — DOI:10.1016/j.jas.2013.07.004.
8. ↑ Adrian M. Whatmore Ancient-Pathogen Genomics: Coming of Age? (англ.) // mBio. — 2014-10-31. — Vol. 5, iss. 5. — P. e01676–14. — ISSN 2150-7511. — DOI:10.1128/mbio.01676-14.
9. ↑ Zoe Patterson Ross, Jennifer Klunk, Gino Fornaciari, Valentina Giuffra, Sebastian Duchêne The paradox of HBV evolution as revealed from a 16th century mummy (англ.) // PLOS Pathogens. — 2018-01-04. — Vol. 14, iss. 1. — P. e1006750. — ISSN 1553-7374. — DOI:10.1371/journal.ppat.1006750.
10. ↑ 1 2 3 4 Michael Hofreiter, David Serre, Hendrik N. Poinar, Melanie Kuch and Svante Pääbo (2001). «Ancient DNA». Nature Reviews Genetics 2: 353—359. DOI:10.1038/35072071.
11. ↑ 1 2 Jesse Dabney et al. (06.08.2013). «Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments». PNAS (201314445): 15758—15763. DOI:10.1073/pnas.1314445110. ISSN 0027-8424.
12. ↑ Pontus Skoglund, Bernd H. Northoff, Michael V. Shunkov, Anatoli P. Derevianko, Svante Pääbo, Johannes Krause, and Mattias Jakobsson. (11 February 2014). «Separating endogenous ancient DNA from modern day contamination in a Siberian Neandertal». Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 111 no. 6: 2229—2234. DOI:10.1073/pnas.1318934111.
13. ↑ Этот метод требует наличия референсного генома. В первом приближении метод выглядит следующим образом. Чтения выравниваются на геном, после чего рассматриваются позиции, где встречаются, например, цитозин и тимин. Сравниваются две модели: одна предполагает, что замена цитозина на тимин произошла в результате посмертной деградации ДНК, вторая предполагает, что это полиморфизм или ошибка секвенирования. Модель выбирается по методу максимального правдоподобия.
14. ↑ 1 2 David Reich et al. (23/30 December 2010). «Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia». Nature vol. 468: 1053—1060. DOI:10.1038/nature09710.
15. ↑ Henrik B. Hansen, Peter B. Damgaard, Ashot Margaryan, Jesper Stenderup, Niels Lynnerup Comparing Ancient DNA Preservation in Petrous Bone and Tooth Cementum (англ.) // PLOS ONE. — 2017-01-27. — Vol. 12, iss. 1. — P. e0170940. — ISSN 1932-6203. — DOI:10.1371/journal.pone.0170940.
16. ↑ Jesse Dabney, Michael Knapp, Isabelle Glocke, Marie-Theres Gansauge, Antje Weihmann Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013-09-24. — Vol. 110, iss. 39. — P. 15758–15763. — ISSN 1091-6490 0027-8424, 1091-6490. — DOI:10.1073/pnas.1314445110.
17. ↑ Iosif Lazaridis, Dani Nadel, Gary Rollefson, Deborah C. Merrett, Nadin Rohland Genomic insights into the origin of farming in the ancient Near East (En) // Nature. — 2016/08. — Т. 536, вып. 7617. — С. 419–424. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature19310.
18. ↑ Beth Shapiro and Michael Hofreiter (eds.). Ancient DNA: Methods and Protocols. — Methods in Molecular Biology. — © Springer Science+Business Media, LLC 2012. — С. vol. 840. — ISBN DOI 10.1007/978-1-61779-516-9_10.
19. ↑ Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA (англ.) // Nature. — 1993. — Vol. 362, no. 6422. — P. 709—715. — DOI:10.1038/362709a0. — PMID 8469282.
20. ↑ S. Blair Hedges, Mary H. Schweitzer (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1191—1192. DOI:10.1126/science.7761839.
21. ↑ В то время сборки человеческого генома ещё не существовало. См. Проект «Геном человека»
22. ↑ Zischler H., Höss M., Handt O., von Haeseler A., van der Kuyl A.C., Goudsmit J. (26 May 1995). «Detecting dinosaur DNA». Science 268 no. 5214: 1193—4. DOI:10.1126/science.7605504.
23. ↑ Web Miller et al. (20 november 2008). «Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth». Nature vol. 456: 387—392. DOI:10.1038/nature07446.
24. ↑ Hendrik N. Poinar et al. (20 January 2006). «Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA». Science vol. 311: 392—394. DOI:10.1126/science.1123360.
25. ↑ Ludovic Orlando et al. (26 June 2013). «Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse». Nature vol. 499: 74—78. DOI:10.1038/nature12323.
26. ↑ Richard E. Green et al. (7 May 2010). «A Draft Sequence of the Neandertal Genome». Science vol. 328: 710—722. DOI:10.1126/science.1188021.
27. ↑ Matthias Meyer et al. (16 January 2014). «A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos». Nature 505: 403—406. DOI:10.1038/nature12788.
28. ↑ 1 2 3 Elizabeth Pennisi (18 April 2014). «Ancient DNA Holds Clues to Gene Activity in Extinct Humans». Science Vol. 344 no. 6181: pp. 245-246. DOI:10.1126/science.344.6181.245.
29. ↑ Briggs et al. (22 Dec 2009). «Removal of deaminated cytosines and detection of in vivo methylation in ancient DNA». Nucl. Acids Res. Vol. 38 (6): pp. e87. DOI:10.1093/nar/gkp1163.
30. ↑ Jakob Skou Pedersen et al. (3 December 2013). «Genome-wide nucleosome map and cytosine methylation levels of an ancient human genome». Genome Res 24: 454—466. DOI:10.1101/gr.163592.113.
31. ↑ 1 2 David Gokhman, Eitan Lavi, Kay Prüfer, Mario F. Fraga, José A. Riancho, Janet Kelso, Svante Pääbo, Eran Meshorer, Liran Carmel (April 17 2014). «Reconstructing the DNA Methylation Maps of the Neandertal and the Denisovan». Science Published Online. DOI:10.1126/science.1250368.
32. ↑ Kirsten I. Bos, Verena J. Schuenemann, G. Brian Golding, Hernán A. Burbano, Nicholas Waglechner A draft genome of Yersinia pestis from victims of the Black Death (En) // Nature. — 2011/10. — Т. 478, вып. 7370. — С. 506–510. — ISSN 1476-4687. — DOI:10.1038/nature10549.
33. ↑ Kentaro Yoshida Verena J Schuenemann Liliana M Cano Marina Pais Bagdevi Mishra Rahul Sharma Chirsta Lanz Frank N Martin Sophien Kamoun Johannes Krause Marco Thines Detlef Weigel Hernán A Burbano The rise and fall of the Phytophthora infestans lineage that triggered the Irish potato famine (англ.) // eLife : Published online. — 2013. — Май.

Литература

wikiredia.ru

Смотрите также

• 
  Мышь древняя
• 
  Древняя мышь
• 
  Кубок древний
• 
  Древние арбалеты
• 
  Арбалеты древние
• 
  Древний пантикапей
• 
  Древние фрукты
• 
  Посох древний
• 
  Древняя венеция
• 
  Венеция древняя
• 
  Латины древние